• amiloidosi
• elettroforesi nativa
• transtiretina

La proteina transtiretina (TTR) è una proteina sintetizzata a livello epatico e nei plessi corioidei e immessa rispettivamente in circolo e a livello del fluido cerebrospinale. La sua conformazione nativa è rappresentata da un omotetramero di 55 kDa derivante dall’associazione di due omodimeri (37 kDa). La sua funzione fisiologica in circolo è di trasportare l’ormone tiroideo tiroxina (T4) e la proteina legante il retinolo (RBP4) grazie alla presenza di siti di legame che si realizzano nella struttura del tetramero.
Negli ultimi anni, l’interesse per lo studio della TTR sta diventando sempre maggiore in quanto si è visto essere coinvolta nell’insorgenza di una condizione patologica nota come amiloidosi da TTR (ATTR), causata dal deposito tissutale di questa proteina in forma fibrillare. Mutazioni in grado di generare varianti strutturali della proteina TTR possono favorire l’insorgenza di condizioni patologiche associate a deposito amiloide come la polineuropatia amiloide familiare (FAP, Familial Amyloid Polineuropathy) e la cardiomiopatia amiloide familiare (FAC, Familial Amyloid Cardiomiopathy).
Sempre più interesse suscita l’amiloidosi da TTR wild-type (ATTRwt) per la quale ancora non sono noti i meccanismi che destabilizzano la struttura tetramerica favorendo la formazione di fibrille insolubili.
Il meccanismo amiloidogenico della proteina TTR è noto: la forma nativa tetramerica tende a dissociarsi nelle sue componenti dimeriche, le quali a loro volta si dissociano in monomeri che sono in grado di aggregarsi e di generare degli oligomeri altamente amiloidogenici. Poiché la destabilizzazione dei tetrameri TTR è un passaggio critico nella formazione dell'amiloide da TTR, recentemente, sono stati valutati come strategia terapeutica farmaci stabilizzatori della forma tetramerica come, ad esempio, il tafamidis.
L’obiettivo di questa tesi è lo studio e la valutazione delle proteine plasmatiche TTR e RBP4 come possibili biomarcatori circolanti in pazienti con amiloidosi cardiaca da TTR (ATTR-CA). Ad oggi, infatti, non sono ancora disponibili marcatori specifici per la ATTR-CA.
Sono stati reclutati 18 soggetti controllo e 31 pazienti con amiloidosi ATTR-CA in terapia con tafamidis e tra controlli e pazienti al tempo basale non si sono osservate differenze significative della concentrazione di TTR, RBP4 e del biomarcatore renale (creatinina). È stata osservata, invece, una differenza significativa della concentrazione dei biomarcatori cardiaci, in particolare, i pazienti con amiloidosi ATTR-CA mostrano un aumento in circolo di hs-cTnT e NT-proBNP, rispettivamente marcatori di danno ai miocardiociti e scompenso cardiaco.
Nei 31 pazienti in terapia con tafamidis TTR e RBP4 sono stati misurati a diversi tempi di prelievo dall’inizio del trattamento (T0, T14, T30, T90, T180). È emerso che i valori di TTR in circolo aumentano, mentre i valori di RBP4 diminuiscono nel tempo. Inoltre, le concentrazioni di TTR e RBP4 sono correlate tra loro al T0, ma con l’assunzione del farmaco viene meno la correlazione tra le due proteine.
TTR e RBP4, quindi, non possono essere utilizzati come biomarcatori di diagnosi, ma l’incremento di TTR dopo l’assunzione di tafamidis potrebbe essere una misura indiretta di efficacia terapeutica.
Questo studio prevede, inoltre, una caratterizzazione preliminare delle forme circolanti di TTR e RBP4 tramite elettroforesi nativa su gel di poliacrilammide associata a western blot, in soggetti di controllo e in pazienti con ATTR-CA per i quali sia disponibile un campione prima e 180 giorni dopo l’inizio del trattamento con tafamidis. L’analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide in gradiente 4-20%, eseguita in condizioni native di 18 soggetti controllo e 18 pazienti ha messo in evidenza la presenza di forme ad alto peso molecolare, probabilmente corrispondenti ad oligomeri e/o aggregati di TTR (> 150 kDa), del tetramero di TTR legato ad 1 o 2 RBP4 (75 kDa) e di trimeri e dimeri di TTR (tra 50 e 37 kDa). Non sempre è presente la forma tetramerica della TTR (55 kDa). Non sono, invece, presenti in circolo il monomero (14 kDa) e la proteina RBP4 in forma libera (21 kDa). In seguito al trattamento con tafamidis si osserva una riduzione delle forme a basso peso molecolare (dimeri e trimeri).
L’elettroforesi nativa su gel in gradiente è anche stata applicata per approfondire le caratteristiche analitiche del metodo nefelometrico utilizzato nell’ambito della medicina di laboratorio per la quantificazione della concentrazione plasmatica della TTR totale.
È stato utilizzato un sistema cromatografico dotato di una colonna per gel-filtrazione e di un raccoglitore di frazioni per separare le forme di TTR e RBP4. Le frazioni dalla numero 14 alla 29 sono state valutate con il metodo immunonefelometrico e successiva indagine elettroforetiche per valutare quali forme di TTR fossero presenti nelle frazioni quantificate al nefelometro. L’elettroforesi ha rivelato che il metodo nefelometrico rileva principalmente tetrameri di TTR legati a 1 o 2 molecole di RBP4 e che RBP4 misurato è quello legato ai tetrameri di TTR.

 
Transthyretin protein (TTR) is a protein synthesized in the liver and choroid plexuses and released into the circulation and cerebrospinal fluid, respectively. Its native conformation is represented by a homotetramer (55 kDa) resulting from the association of two homodimers (37 kDa). Its physiological function in the circulation is the transport of thyroid hormone thyroxine (T4) and retinol-binding protein (RBP4).
In recent years, interest in the study of TTR has been growing as it has been seen to be involved in the onset of a pathological condition known as TTR amyloidosis (ATTR), which is associated with tissue deposition of this protein in a fibrillar form. Mutations able of generating structural variants of the TTR protein can promote the onset of pathological conditions associated with amyloid deposition such as Familial Amyloid Polyneuropathy (FAP) and Familial Amyloid Cardiomyopathy (FAC). There is increasing interest in wild-type TTR amyloidosis (ATTRwt) for which the mechanisms that destabilize the tetrameric structure by promoting the formation of insoluble fibrils are still unknown. The amyloidogenic mechanism of TTR proteins is known: the native tetrameric form dissociates into its dimeric components, which in turn dissociate into monomers that are capable of aggregating and generating highly amyloidogenic oligomers. Because destabilization of TTR tetramers is a critical step in the formation of amyloid from TTR, recently, tetrameric stabilizing drugs, such as tafamidis, have been evaluated as a therapeutic strategy.
The aim of this thesis is to study and evaluate plasma TTR and RBP4 proteins as possible circulating biomarkers in patients with cardiac amyloidosis by TTR (ATTR-CA). To date no specific markers are yet available for ATTR-CA.
Control subjects (n=18) and patients with ATTR-CA amyloidosis on tafamidis therapy were recruited (n=31): no significant differences in TTR, RBP4, and renal biomarker (creatinine) concentrations were observed between controls and patients at baseline. In contrast, a significant difference in the concentration of cardiac biomarkers was observed patients with ATTR-CA amyloidosis show an increase in circulating hs-cTnT and NT-proBNP, markers of myocardial damage and heart failure, respectively.
In the 31 patients, TTR and RBP4 were measured at different sampling times from the start of treatment with tafamidis (T0, T14, T30, T90, T180). It was found that circulating TTR values increased, while RBP4 values decreased over time. In addition, TTR and RBP4 concentrations correlated with each other at T0, but with drug intake, the correlation between the two proteins is lost.
TTR and RBP4, therefore, cannot be used as biomarkers of diagnosis, but the increase in TTR after tafamidis intake could be an indirect measure of therapeutic efficacy.
In addition, this study involves a preliminary characterization of circulating forms of TTR and RBP4 by gel electrophoresis followed by western blot, in control subjects and patients with ATTR-CA for whom a sample is available before and 180 days after the start of tafamidis treatment. Electrophoretic analysis on 4-20% gradient polyacrylamide gels performed under native conditions of 18 control subjects and 18 patients revealed the presence of high-molecular-weight forms, probably corresponding to oligomers and/or aggregates of TTR (> 150 kDa), the tetramer of TTR bound to 1 or 2 RBP4 (75 kDa), and trimer and dimer forms of TTR (between 50 and 37 kDa). The tetrameric form of TTR (55 kDa) is not always present. In contrast, the monomer (14 kDa) and the free-form RBP4 protein (21 kDa) are not present in circulation. Following tafamidis treatment, a reduction in low molecular weight forms (dimers and trimers) is observed.
Native gradient gel electrophoresis was also applied to further investigate the analytical characteristics of the nephelometric method used in laboratory medicine for quantifying the plasma concentration of total TTR.
A chromatographic system equipped with a gel-filtration column and a fraction collector was used to separate the forms of TTR and RBP4. Fractions number 14 through 29 were evaluated by the immunonephelometric method and subsequent electrophoretic investigation to assess which forms of TTR were present in the fractions quantified by nephelometer. Electrophoresis revealed that the nephelometric method mainly detects tetramers of TTR bound to 1 or 2 molecules of RBP4 and that RBP4 measured is that bound to the tetramers of TTR.