• apoptosi
• autofagia
• cellule staminali
• differenziamento
• Dugesia japonica
• HKATPase
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La Sanguinarina (13-methyl[1,3]benzodioxolo[5,6-c]-1,3-dioxolo [4, 5-i] phenanthridium) è un alcaloide benzofenantridinico presente in alcune piante come Sanguinaria canadensis (radice), Chelidonium majus e Macleaya cordata. Possiede proprietà antimicrobiche, anti-infiammatorie ed antiossidanti. Viene utilizzata nei dentifrici nel trattamento e nella prevenzione di gengiviti ed altre condizioni infiammatorie, ma anche in acquacoltura o in ambito veterinario. La sanguinarina è in grado di intercalarsi tra le basi del DNA e dell’RNA alterandone la struttura ed il metabolismo. I suoi effetti inibitori si realizzano a livello di proteine quali Na+/K+ e Ca2+-ATPasi bloccando i gruppi SH essenziali per la loro attività. E’ anche un potente inibitore della proteina chinasi C ed infine blocca l’assemblaggio dei microtubuli. Recenti studi hanno rivelato che a concentrazioni micromolari, questo alcaloide è anche in grado di inibire la crescita tumorale attraverso la via apoptotica. Nonostante gli effetti di questo alcaloide siano stati ampiamente studiati e descritti in vitro, ad oggi non sono ancora noti i suoi effetti in vivo. Lo scopo del mio studio è stato quello di analizzare in vivo gli effetti prodotti dalla sanguinarina nella planaria Dugesia japonica, un animale modello noto per la straordinaria capacità rigenerativa basata su l’attività di cellule staminali (i neoblasti) e, proprio per questo, recentemente utilizzato per studi farmacologici e tossicologici. La rigenerazione in planaria è un processo complesso che implica, in seguito ad una lesione, il rimodellamento dei tessuti pre-esistenti e l’attivazione e migrazione dei neoblasti nel punto in cui è avvenuta tale lesione con riformazione delle parti mancanti (blastema rigenerativo). Nel mio lavoro di tesi ho inizialmente effettuato una valutazione tossicologica della molecola con probit analysis, un metodo di calcolo comunemente usato in tossicologia per determinare la tossicità relativa di sostanze chimiche testate su organismi viventi. A questo è seguita l’osservazione diretta dei fenotipi morfologici ottenuti in seguito al trattamento con sanguinarina alla concentrazione di 0,15 μM. Gli animali, osservati a 7 giorni di rigenerazione, mostrano evidenti anormalità soprattutto durante la rigenerazione della testa rispetto agli animali di controllo. L’analisi morfometrica del rapporto tra l’area del blastema e quella dell’intero corpo ha evidenziato che l’esposizione a questa sostanza causa una riduzione significativa delle dimensioni del blastema negli animali trattati rispetto agli animali controllo. Esperimenti di immunostaining e di ibridazioni in situ con marcatori molecolari specifici del sistema nervoso e visivo hanno evidenziato evidenti anomalie nella rigenerazione di queste strutture. Inoltre, sono stati analizzati gli effetti prodotti dalla sanguinarina sulla proliferazione cellulare e apoptosi. La sanguinarina infatti promuove il processo apoptotico attraverso il pathway mitocondriale con attivazione in ultima analisi di specifiche proteasi note con il nome di caspasi. L’analisi spettrofotometrica basata sull’attività della caspasi-3 conferma un aumento di tale fenomeno negli animali trattati con sanguinarina rispetto agli animali di controllo. Inoltre, sono stati valutati i livelli di espressione di marcatori specifici della proliferazione cellulare e marcatori specifici di cellule staminali tramite RT-qPCR. Quest’analisi, effettuata a 7 giorni di rigenerazione, non evidenzia alcun effetto sulla proliferazione delle cellule staminali. Al contrario, il trattamento con sanguinarina ha evidenziato un notevole aumento nel livello di espressione di alcuni marcatori che svolgono un ruolo nel maintenance/differenziamento di queste cellule. Inoltre, l’identificazione dei meccanismi biologici con cui agisce questo alcaloide a livello delle cellule staminali potrebbe avere importanti risvolti non solo per il suo utilizzo nella terapia antitumorale ma anche per una possibile applicazione nella medicina rigenerativa.