• cisplatino
• glutatione transferasi omega

Le glutatione transferasi citosoliche umane rappresentano la famiglia più ampia ed eterogenea di gst, si dividono in sette classi, tra tutte la classe omega è la più recentemente identificata. La prima GSTO è stata purificata nel nostro laboratorio grazie alla sua capacità di ridurre l’acido deidroasc ad acido ascorbico. Nell’uomo esistono due GSTO denominate appunto gsto1 e gsto2, hanno un’omologia aa del 64 % e una cisterna nel sito attivo anziché una ser o tiroxina normalmente presente nelle altre glutationi transferasi, forse proprio a causa di questa caratteristica le GSTO non hanno pressocchè attività glutatione transferasica, mostrano però una serie di caratteristiche assai peculiari: attività deisroascorbatoreduttasica, attività monometil e dimetil arsenato reduttasica, hanno un ruolo nella processazione post-traduzionale dell’interleuchina 1 ecct.
Nel laboratorio dove ho svolto la tesi è stato dimostrato che la sovraespressione della GSTO1 in cellule in coltura è direttamente correlata all’acquisizione del fenotipo resistente al trattamento con il cisplatino. Lo scopo della mia tesi è stato quindi di studiare i meccanismi di tale chemioresistenza. A tal fine sono state utilizzate cellule HeLa sabilmente transfettate con la GSTO1. Abbiamo quindi valutato se ci fossero differenze nell’uptake del farmaco tra le Hela che sovraesprimono la GSTO1 rispetto alle cellule di controllo ma il contenuto di cisplatino è risultato simile nelle due linee cellulari. Dal momento che è noto che in alcuni casi per esempio bcl 2 e l’hsp27, la transfezione stabile comporta un aumento dei livelli di glutatione abbiamo verificato se fosse questo il caso ma anche il contenuto di GSH è pressocchè identico nelle due linee cellulari. Tramite il test della cometa (Comet) abbiamo verificato se ci fossero delle differenze nell’entità del danno al DNA ma di nuovo non ci sono differenze significative. Infine abbiamo verificato se ci fossero delle differenze nella percentuale delle cellule che vanno in apoptosi in seguito al trattamento, abbiamo quindi colorato le cellule con l’ HOECST e contato quante erano in apoptosi rispetto al totale: il clone che sovraesprime la GSTO1 mostra con il 38 % di cellule in apoptosi mentre il controllo arriva a valori superiori all’80%. L’annessina V è stata utilizzata per la conferma specifica dell’ apoptosi. Come noto che le GST hanno almeno due ruoli distinti nei meccanismi di resistenza ai farmaci , direttamente come detossificanti, oppure come accade ad esemp per la GSTm1 e GSTp 1 bloccanondo l’apoptosi attraverso l’inibizione della cascata di attivazione delle map kinasi tenendo sequestrate alcune di loro, in particolare JNK1 per la GST p1 e AKT per la GSTm1. Siamo quindi andati a verificare, tramite wstern blotting, i livelli di fosforilazione delle MAP Kinasi e di ASK1. I livelli di fosforilazione di AKT e ERK1/”2 risultano aumentati nelle cellule che overesprimono la GSTO1 rispetto al controllo a due ore dal trattamento con cisplatino mentre non variano i livelli di p38 e JNK.
I livelli di fosforilazione di JNK sono invece molto alti dopo dieci e venti ore dal trattamento nelle cellule di controllo mentre rimangono bassi nelle cellule che esprimono alti livelli di GSTO1.
La GSTO1 sembrerebbe quindi entrare a far parte del meccanismo antiapoptotico che porta all’aumento della resistenza al trattamento con cisplatino aumentando i livelli di fosforilazione di ERK1/2 e AKT e diminuendo quelli di JNK.