• CC50
• citotossicità
• citotoxicity
• composto; drug
• IC50
• inibizione virale
• viral inhibition
• Zika virus

I virus Zika (ZIKV) e Usutu (USUV) appartengono alla famiglia dei Flaviviridae. Sono caratterizzati da un genoma a RNA a polarità positiva, che codifica per tre proteine strutturali e sette non strutturali.
Zika è stato isolato per la prima volta nel 1947 in Uganda da un esemplare di macaco rhesus e, successivamente, la zanzara del genere Aedes aegypti è stata identificata come principale vettore di trasmissione. Inizialmente sono stati osservati casi sporadici di infezione da ZIKV in Africa e in Asia, dove i pazienti mostravano sintomi molto blandi o assenti. Nel 2007 si assiste ad un’epidemia nelle isole Yap del Pacifico e, a seguire nel 2016 in Brasile, a casi di infezione associati a microcefalia nel feto di donne infette. Per questo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha dichiarato ZIKV una emergenza sanitaria di importanza mondiale. Il rilevamento di casi autoctoni in Francia nel 2019 ha dimostrato che ZIKV ha potenziale epidemico anche in Europa, da qui il crescente interesse nello sviluppo di terapie antivirali.
USUV è stato isolato per la prima volta nel 1959 in Sud Africa nella zanzara Culex neavei, e successivamente è stato individuato anche in Europa centrale, finché nel 2018 ha iniziato a diffondersi nell’est d’Europa, in concomitanza con il virus West Nile (WNV), come causa principale dell’encefalite da arbovirus. In particolare, USUV condivide con WNV similarità a livello genetico, antigenico ed epidemiologico, quindi lo sviluppo di terapie per Usutu può risultare utile anche per il trattamento con WNV.
Lo scopo della tesi presente è quello di valutare l’efficacia di composti antivirali, sintetizzati dall’Università di Sassari, contro ZIKV e USUV.
In via preliminare, è stato ottimizzato un saggio dell’effetto citopatico (CPE) su cellule HUH7 per uno screening iniziale, in modo da individuare i composti per i quali era opportuno approfondirne lo studio. Per le molecole selezionate, è stata calcolata la concentrazione citotossica che porta alla morte del 50% delle cellule (CC50), attraverso dei saggi di vitalità cellulare. Dopodiché sono stati effettuati dei saggi di riduzione della resa virale, infettando inizialmente cellule HUH7 e aggiungendo, successivamente all’infezione, concentrazioni scalari di composto; il range di concentrazioni di composto utilizzate sono state scelte in base ai risultati del saggio CPE. I surnatanti delle cellule infettate e trattate con i composti sono stati titolati per contenuto di ZIKV su cellule VERO E6 al fine di calcolare la concentrazione alla quale si osserva una riduzione del titolo virale del 50% (IC50). In questo modo è stato possibile calcolare l’indice di selettività, il rapporto tra CC50 e IC50.
A questo punto sono stati effettuati dei saggi del tempo di somministrazione (TOA), nei quali il composto è stato dato alle cellule a differenti tempi: pre-incubando ogni composto alla concentrazione 5 volte l’IC50 prima con il virus o con le cellule; durante l’infezione; dopo 2 ore dall’infezione e dopo 6 ore. Così facendo è stato possibile capire in quale momento dell’infezione il composto agisse meglio, come spia della sua modalità di azione.
Infine, attraverso la tecnica del Western Blot, è stato possibile andare a valutare la presenza di proteine virali nelle cellule.
In questo modo è stato possibile identificare almeno due composti molto promettenti, con una attività nel range micromolare su ZIKV, che, eccetto uno, si sono dimostrati efficaci anche su USUV.