• 3'UTR
• BRAF
• miRNA

BRAF è una treonina-serina chinasi che fa parte del pathway RAS/RAF/MEK/ERK, fondamentale per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Questa proteina è mutata nel 50-60% dei casi di melanoma (la più aggressiva forma di tumore della pelle). La mutazione più ricorrente (98% dei casi) è la sostituzione di una valina con un glutammato in posizione 600 (V600E) che rende BRAF costitutivamente attiva, determinando una proliferazione cellulare incontrollata. BRAFV600E è stata individuata come bersaglio terapeutico per la cura del melanoma metastatico, che ad oggi presenta un’elevata frequenza di morbilità e mortalità a livello globale. Gli inibitori selettivi di BRAF mutato (BRAF inibitori) funzionano meglio dei chemioterapici, ma non sono privi di limitazioni che devono essere superate.
Partendo dall’assunto che un targeting più efficace di BRAFV600E non può prescindere da una più approfondita conoscenza della regolazione della sua espressione, recentemente nel laboratorio in cui ho svolto il tirocinio di tesi è stato scoperto che l’oncogene BRAF è trascritto in 3 isoforme (reference BRAF, BRAF-X1 e BRAF-X2), che differiscono nella parte terminale della sequenza codificante e nella 3’UTR. L’isoforma BRAF-X1 è quella maggiormente espressa nel melanoma ed è caratterizzata da una 3’UTR lunga circa 7000 nucleotidi. Data l’elevata lunghezza, la 3’UTR di BRAF-X1 potrebbe essere coinvolta nella regolazione post-trascrizionale mediata dai microRNA (miRNA) o da proteine che legano l’RNA (RBP).
Durante la mia tesi ho contribuito allo sviluppo di un metodo innovativo per lo studio dei miRNA che legano l’X1 3’UTR, il miR-CATCHv2.0, basato sulla precipitazione di affinità dell’mRNA d’interesse con i miRNA che vi si trovano legati. Utilizzando questa tecnica sono stati identificati 20 miRNA. Lo scopo del mio progetto di tesi è stato quello di validare sperimentalmente l’interazione dei miRNA individuati con BRAF-X1. Inizialmente, utilizzando il saggio MS2-tagged RNA affinity purification (MS2-TRAP), ho confermato che i 20 miRNA identificati si legano tutti fisicamente a BRAF-X1 3’UTR. Successivamente, attraverso il saggio della luciferasi, ho verificato che, tra questi 20 miRNA, 10 (miR-320b, 423-5p, 619-5p, 1246, 3180-3p, 3651, 5096, 7704 e let-7b-5p, let-7e-5p) sono in grado di diminuire l’espressione e quindi l’attività dell’enzima, confermando un ruolo funzionale diretto. Ho poi testato l’effetto dei 10 miRNA sui livelli intracellulari di BRAF con una trasfezione in cellule A375 (linea di melanoma metastatico) seguita da western blot. Il risultato è stato che miR-320b, 423-5p, 619-5p, 1246, let-7b-5p e let-7e-5p sono in grado di diminuire i livelli si espressione di BRAF. Ho anche studiato l’effetto sul signaling del pathway di ERK, attraverso il western blot della forma fosforilata di MEK (un effettore a valle di BRAF). Ho così ottenuto che i miR-619-5p e let-7b-5p causano anche una diminuzione di pMEK. Infine, attraverso saggi di proliferazione (curva di crescita e saggio di formazione di colonie) ho osservato che miR-619-5p e let-7b-5p determinano una riduzione della proliferazione.
Con i risultati di questi esperimenti, ho dimostrato che il miR-CATCHv2.0 è un valido metodo per identificare i miRNA che si legano ad un mRNA di interesse. In particolare, ho trovato che miR-619-5p e let-7b-5p si legano a BRAF-X1 3’UTR con conseguente diminuzione dei livelli della proteina di BRAF ed inibizione dell’ERK signaling.