• Next Generation Sequencing
• Carcinoma della mammella maschile
• BRCA2
• BRCA1

Il carcinoma della mammella maschile (MBC) rappresenta circa lo 0,5-1% di tutti i casi di tumore mammario. A causa della sua rarità questa patologia resta ancora poco conosciuta. La maggior parte dei pazienti alla diagnosi presenta un carcinoma ad uno stadio avanzato. Nella quasi totalità dei casi i tumori della mammella maschile esprimono i recettori ormonali per estrogeni (ER) e progesterone (PR), invece è meno frequente l’amplificazione della sequenza codificante del gene HER2-neu. In rari casi, i tumori non esprimono nessuno di questi recettori e sono definiti tripli negativi (TNBC). La terapia adiuvante standard segue le stesse linee guida del tumore mammario femminile. I principali fattori di rischio includono malattie testicolari, ginecomastia, le sindromi di Klinefelter e di Cowden, ma il più importante è rappresentato dalle mutazioni nei geni di suscettibilità al cancro della mammella BRCA1 e soprattutto BRCA2, che spiegano dal 15 al 20% di tutti i casi.
Lo scopo del presente lavoro è di eseguire uno screening mutazionale in NGS di geni di predisposizione al cancro su DNA estratto da linfociti del sangue periferico di pazienti affetti da carcinoma della mammella maschile, al fine di evidenziare possibili alterazioni genetiche coinvolte nell’insorgenza della patologia, candidabili a fattori di rischio.
La collaborazione tra la SOD di Genetica Molecolare (AOUP) e l'unità di Epidemiologia diretta dal Dott. Palli (ISPO, Firenze) ha permesso di arruolare 75 uomini con carcinoma della mammella. Di questi, 42 avevano storia familiare di cancro alla mammella/ovaio (mbc), mentre 33 rappresentavano l’unico caso di cancro in famiglia (casi sporadici, sc). Per ciascun paziente sono stati raccolti un campione di sangue periferico, i dati clinico-patologici e ricostruita la storia familiare con particolare attenzione alle patologie tumorali. L’età media d’insorgenza era 61,53 anni. La maggior parte dei pazienti presentava alla diagnosi un carcinoma invasivo, tutti avevano i recettori ormonali espressi ed erano HER2-neu negativi, solo 2 casi avevano amplificazione di HER2-neu; 1 caso aveva tumore triplo negativo. Per la caratterizzazione genetica sono stati selezionati 24 geni coinvolti nei sistemi di riparazione del DNA e nel controllo del ciclo cellulare: BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD51C, RAD52 (Ricombinazione Omologa, HR), MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2 (Mismatch Repair, MMR), ERCC1 (Nucleotide Excision Repair, NER), MUTYH, PARP1 (Base Excision Repair, BER), MRE11, RAD50, NBN (complesso MRN), CDH1, PTEN, STK11, TP53 e TP53BP1. Il DNA dei pazienti, estratto da linfociti di sangue periferico, è stato analizzato in Next Generation Sequencing (NGS) attraverso un pannello custom in grado di coprire le regioni codificanti e le giunzioni esone-introne dei 24 geni. Le varianti trovate nel genoma di ciascun paziente rispetto al genoma di riferimento (hg19) sono state riportate nei Variant Calling Files (VCFs), che sono stati utilizzati per il filtraggio delle varianti. Sono state selezionate le varianti esoniche missense, nonsense, frameshift e le varianti che alterano lo splicing, con coverage bilanciato e con Minor Allele Frequency (MAF) minore dell’1%. Successivamente, l’effetto biologico delle varianti sulle proteine è stato valutato attraverso software di predizione in silico (SIFT, POLYPHEN e Mutation Taster). La probabilità di patogenicità ottenuta dai software è stata integrata con i dati riportati in letteratura. Tutte le varianti rare patogenetiche, o predette tali, e quelle di significato clinico sconosciuto (VUS) sono state confermate con la tecnologia del sequenziamento diretto secondo Sanger. La presenza di grandi riarrangiamenti nella sequenza genica di BRCA1 e BRCA2 è stata esclusa mediante l’analisi Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA).
BRCA2 rappresenta il gene più frequentemente mutato come riportato in letteratura. Infatti, 11 pazienti su 75 (14,6%) sono portatori di una mutazione patogenetica. Sebbene in nessun caso sia stata identificata una mutazione patogenetica su BRCA1, 2 diverse mutazioni sono state trovate in BRIP1, suo diretto partner. Una mutazione patogenetica nel gene MUTYH è stata identificata in un caso familiare, mentre una mutazione patogenetica in PMS2 è stata trovata in un paziente senza storia familiare. L’analisi dei pazienti senza mutazioni ha portato all’identificazione di 11 VUS in 9 geni che potrebbero rivestire un ruolo nell’insorgenza della patologia: BARD1 (c.1915T>C, p.C639R, rs587781376), BRCA1 (c.5468-5T>G, rs730881498; c.2018A>G, p.E673G, novel), BRIP1 (c.139C>G, p.P47A, rs28903098), CHEK2 (c.1312G>T, p.D481Y, rs200050883; c.545C>A, p.P225H, rs372168051), ERCC1 (c.499C>T, p.R167W, novel), NBN (c.547G>A, p.A183T, rs151070415), PALB2 (c.3428T>A, p.L1143H, rs62625284), PMS1 (c.1609G>A, p.E537K, rs151325573) e RAD50 (c.1277A>G, p.Q426R, rs145428112). Complessivamente sono state identificate mutazioni patogenetiche e varianti predette patogenetiche in 12 geni su 24: di questi 8 sono coinvolti nel pathway molecolare della ricombinazione omologa (66,6%), 2 nel sistema di riparo del MMR (16,6%) e 1 rispettivamente nel sistema di riparo del BER e NER (8,3%).
In conclusione, il pannello custom utilizzato ha permesso di identificare varianti patogenetiche in geni diversi da BRCA1/2 aumentando il mutation detection rate del 5,4% (4/75) nei nostri casi. Il pathway molecolare più colpito è quello della ricombinazione omologa, in cui possono essere identificati nuovi possibili fattori di rischio genetici predisponenti allo sviluppo del carcinoma della mammella maschile.