• Saccharomyces cerevisiae
• saggio di luciferasi
• saponine
• luciferase assay
• p53
• saponins

p53, codificato dal gene oncosoppressore TP53, è un fattore di trascrizione cruciale per la vita della cellula.
La sua funzione principale è, infatti, quella di mantenere l’integrità del genoma in risposta a vari tipi di stress come, per esempio, danno al DNA o attivazione di oncogeni.
La risposta allo stress si esplica tramite l’avvio di vari processi come arresto del ciclo cellulare, senescenza ed apoptosi, grazie alla regolazione, da parte di p53, di diversi geni coinvolti nei medesimi processi. A sua volta l’attività di p53 può essere influenzata da numerosi fattori come proteine regolatrici e piccole molecole.
Lo scopo della tesi è quello di valutare l’effetto di metaboliti secondari vegetali, saggiati singolarmente e/o in combinazione con farmaci antitumorali, sul potenziale di transattivazione di p53 in Saccharomyces cerevisiae, utilizzando un saggio funzionale di luciferasi precedentemente sviluppato.
Il saggio è stato messo a punto con lo scopo di valutare l’effetto delle sostanze sul potenziale di transattivazione di un TF potendo usufruire di numerosi vantaggi, quali:
- Espressione variabile del TF sotto il controllo del promotore inducibile GAL1,10
- Presenza in singola copia di un Responsive Element del TF e di geni reporter di controllo
- Miglior assorbimento e accumulo delle molecole in esame grazie alla presenza di trasportatori ABC modificati
- Utilizzo di piccoli volumi per i trattamenti e il saggio funzionale
- Possibilità di co-esprimere il TF con altri cofattori
- Adattabilità a diversi TF così come p53
- Applicabilità a diversi sistemi cellulari
I metaboliti secondari testati, comunemente noti come saponine, sono stati estratti della pianta Astragalus verrucosus, in particolare in questo studio sono state saggiate frazioni contenenti diverse combinazioni di saponine e saponine singole quali Astraverrucina I, Astraverrucina III, Astraverrucina VI e Cicloalaroside D. Queste sostanze sono note per le loro proprietà farmaco-terapiche tra cui riduzione del colesterolo, riduzione del rischio di cancro, attività antiossidante ed immuno-stimolante. Come farmaci antitumorali sono stati utilizzati due agenti chemioterapici, quali Mitomicina C e Doxorubicina, sia singolarmente sia in combinazione con i suddetti metaboliti al fine di valutare un eventuale effetto delle saponine sull’azione del farmaco.
Dai risultati ottenuti si evince che le frazioni di saponine mostrano effetti inibitori significativi sulla transattivazione di p53, mentre se testate in combinazione con Mitomicina C e Doxorubicina esercitano un effetto di ripristino dell’attività di p53 quando paragonate all’azione singolare del farmaco. Le saponine singole allo stesso modo mostrano un significativo effetto inibitoro sul potenziale di transattivazione di p53 quando testate singolarmente mentre incrementano l’azione inibitoria dei farmaci quando usate in combinazione.
L'effetto delle frazioni di saponine è stato saggiato anche sul potenziale di transattivazione di p53 co-espressa con la proteina regolatrice MDM2, in grado di inibirne l'azione, al fine di verificare un comportamento simile a Nutlin, da parte delle medesime sostanze. Nutlin è, infatti, una molecola in grado di rompere il legame tra p53 e MDM2. Dai risultati è emerso che la maggior parte delle frazioni si comporta in modo simile a Nutlin, talvolta producendo un effetto maggiore.
Infine si è verificato un eventuale effetto sull’espressione di p53 da parte delle sostanze utilizzando la tecnica del Western Blot. Nessuna sostanza ha mostrato di esercitare effetti significativi sulla sintesi di p53.