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Il sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas si è evoluto nei Procarioti come sistema immunitario di carattere adattativo permettendo ai batteri di difendersi dagli attacchi infettivi dei batteriofagi. L’interesse scientifico si è focalizzato principalmente sul sistema CRISPR/Cas9 di tipo II, identificato per la prima volta nello Streptococcus Pyogenes, che è in grado di produrre taglio a doppio filamento (DSB) nel gene d’interesse. Il sistema è formato da una ribonucleoproteina, costituita dall’endonucleasi Cas9 seguita da un RNA guida di 20-nt (sgRNA). La ribonucleoproteina è in grado di identificare nel genoma la sequenza PAM (Protospacer Adjacent Motifs), sequenza trinucleotidica altamente rappresentata (5’-NGG-3’), preceduta da una sequenza complementare al sgRNA realizzando quindi il DSB. Quest’ultimo verrà riparato dalla cellula con i meccanismi di ricombinazione non omologa (NHEJ), che introduce mutazioni indel, o tramite ricombinazione omologa (HDR), che viceversa ripara il DSB senza inserire alcuna mutazione.
La presente tesi si propone di individuare principalmente i metodi per effettuare il “gene editing” mediante CRISPR/Cas9 su linee cellulari immortalizzate, con lo scopo ultimo di “creare” linee isogeniche che differiranno per il solo nucleotide dello SNP di nostro interesse (rs4644 del gene LGALS3).
La prima tecnica impiega l’agente chimico trasfettante Lipofectamine 3000 per la trasfezione in cellule immortalizzate del plasmide SpCas9D10a esprimente il gene Cas9 ligato alla migliore sgRNA predetta in silico. Una volta trasfettato, il plasmide produrrà un singolo taglio a livello dell’allele variante C che verrà riparato da una sequenza a singolo filamento (ssODN) avente l’allele protettivo (A) e sequenze fiancheggianti (lunghe 40 bp) omologhe al sito target. Nella costruzione della sequenza a singolo filamento (ssODN) sono state riportate tre mutazioni silenti, poiché le triplette originarie rappresentavano nuove e possibili sequenze PAM.
La seconda tecnica permette di compiere una co-trasfezione, con l’uso sempre dell’agente Lipofectamine 3000, del plasmide SpCas9D10a e il vettore donor HR410PA munito di marcatore cellulare EGFP-Puromicina fiancheggiato da due siti Lox-P, costruito tramite un doppio clonaggio sia della porzione dell’esone (a genotipo noto A/A per lo SNP di nostro interesse) del gene LGALS3 e sia di una porzione dell’introne del gene LGALS3. Come per il singolo filamento, anche nella porzione esonica clonata bisognerà apportare delle mutazioni silenti con una mutagenesi sito diretta per “eliminare” le originarie sequenze PAM.
La terza tecnica utilizza il sistema lentivirale come “veicolo” di trasfezione del plasmide pCW-Cas9 (con Cas9 inducibile da doxyciclina e resistenza alla puromicina) e del vettore pLX-sgRNA (con sgRNA target e con resistenza alla blasticidina).
Dai primi risultati ottenuti, due tecniche ci permetteranno di individuare e di creare nel miglior modo possibile e nel minor tempo possibile linee isogeniche di nostro interesse. La prima è quella che prevede l’impiego del plasmide HR, in quanto presente un marcatore di selezione per le cellule che hanno subito ricombinazione omologa. La seconda è quella che utilizza i vettori lentivirali poiché viene ridotto al minimo il problema dell’efficienza di trasfezione: solo le cellule che sono state infettate presenteranno resistenza al farmaco di selezione.