• genome editing
• vitamine C
• vitamina C
• AsA
• ascorbic acid
• acido ascorbico
• ascorbato
• Lactuca
• Lactuca sativa
• CRISPR/Cas9

Lactuca sativa L. (famiglia delle Asteraceae) è considerata una delle più importanti colture orticole da foglia per il diffuso consumo alimentare e la vasta produzione a livello globale. Nel 2017 è stato sequenziato e assemblato per la prima volta il genoma di L. sativa cv. ‘Salinas’ (Reyes-Chin-Wo et al., 2017). Ciò ha permesso di applicare su lattuga le più recenti tecniche di miglioramento genetico, tra cui il genome editing.
Aumentare la quantità di acido ascorbico (AsA, vitamina C) nelle piante è un obiettivo che porterebbe diversi vantaggi, non solo per l’importanza di questa vitamina dal punto di vista nutrizionale per l’uomo, ma anche per il ruolo fondamentale che questa molecola ha durante la risposta allo stress durante la coltivazione e per l’inibizione dell’imbrunimento post-raccolta in piante come la lattuga.
Precedentemente al progetto di questa tesi, in Lactuca sativa cv. ‘Cobham Green’, è stato effettuato un knockout genico, attraverso la tecnica CRISPR/Cas9, dei geni LsMDHAR1 LsMDHAR2, LsMDHAR3 e LsMDHAR4 codificanti quattro isoforme dell’enzima monodeidroascorbato reduttasi (MDHAR) coinvolte nel riciclo di acido ascorbico. Il knockout dei geni scelti ha richiesto la progettazione di quattro guide ad RNA (gRNA) per ogni gene bersaglio. Per la costruzione degli opportuni plasmidi necessari al genome editing è stata utilizzata la tecnica Golden Gate Cloning (Engler et al., 2008). Ogni plasmide è stato introdotto in Agrobacterium tumefaciens (ceppo LBA4404) con cui sono stati infettati espianti cotiledonari in vitro. Successivamente alla rigenerazione e adattamento delle piante alla crescita ex-vitro è stato estratto da ogni campione il DNA totale per la caratterizzazione molecolare. Sono state selezionate le piante della generazione T1 positive all’integrazione di Cas9 o del gene marker NPTII (resistenza alla kanamicina). Successivamente, sono state amplificate, tramite PCR le regioni in corrispondenza delle guide disegnate per l’editing genomico. Dai risultati del sequenziamento, e/o direttamente mediante PCR (quando presenti grandi delezioni), sono state caratterizzate complessivamente 14 piante T1 editate. Le piante positive sono state allevate fino al completamento del ciclo vitale ed autofecondate per ottenere progenie di semi della generazione T2. Il successivo lavoro di caratterizzazione molecolare è stato condotto sulle piante della generazione T2 allo scopo di identificare genotipi che presentavano eventi di editing molecolare in condizione di omozigosi (mutanti knockout) per i singoli geni bersaglio.
Le piante positive all’editing della generazione T2 portate a fioritura ed autofecondate hanno dato origine ai semi della generazione T3 utilizzati nella presente tesi. Le linee editate sono state denominate M1, M2, M3 e M4. Piante wild-type (CG) della stessa cultivar sono state usate come controllo.
Inizialmente sono state valutate piante per ogni gene editato a 14 e 28 giorni dal trasferimento in vaso. Per ognuna delle due fasi temporali, sono state utilizzate cinque repliche biologiche per genotipo per le analisi sul contenuto di acido ascorbico. L’AsA è stato estratto usando il protocollo proposto da Gillespie e Ainsworth (2007) che prevede di effettuare analisi spettrofotometrica. I dati dell’assorbanza sono stati trascritti su Microsoft Excel e grazie ad una retta di taratura precedentemente messa a punto sono state ottenute le quantità di AsA totale e AsA ridotto espresse in mg×100 g-1 FW (fresh weight). È stato calcolato anche lo stato redox dell’ascorbato (AsA ridotto/AsA totale). I dati ricavati da queste analisi sono stati analizzati con il test One-way ANOVA. Tutte le medie sono state separate usando il Bonferroni post-hoc test. Tre repliche biologiche delle piante cresciute per 14 e 28 giorni sono state impiegate per le analisi di espressione genica dei geni LsMDHAR1-4 tramite Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR). Il gene Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (LsGAPDH1) è stato usato come gene housekeeping di riferimento. I dati dell’espressione relativa sono stati analizzati con il test One-way ANOVA. Tutte le medie sono state separate usando il Bonferroni post-hoc test. Grazie queste analisi è stato possibile osservare una riduzione significativa nei livelli di AsA nella linea M3 ed è stata verificata la capacità dell’editing di ridurre significativamente l’espressione del gene mutato per le linee M2, M3 ed M4. Si può ipotizzare che ciò sia dovuto alla degradazione degli RNA messaggeri mediato da mutazioni nonsenso (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), per prevenire l'accumulo di proteine tronche e potenzialmente deleterie (Nicholson and Mühlemann, 2010).
Si è valutato il peso secco di piante sottoposte a stress luminoso e piante usate per le prove preliminari con stress salino, (dry weight, DW). Su questi dati è stato applicato il test t di Student. Le analisi di acido ascorbico e di espressione sono state condotte in maniera analoga su piante trattate con soluzione salina (NaCl 200 mM) con cinque tempi di trattamento (T0, 24h, 48h, 72h e 18gg). I dati derivanti dall’estrazione dell’AsA e quelli dell’espressione relativa dei geni LsMDHAR2, LsDHAR1, LsDHAR2 e LsAPX1 sono stati analizzati con il test Two-way ANOVA. Tutte le medie sono state separate usando il Bonferroni post-hoc test. Non sono riportate variazioni significative nei livelli di AsA, mentre è stato osservato un aumento dell’espressione del gene LsAPX1 nel mutante M4 dopo 18 giorni di trattamento. Ulteriori analisi saranno necessarie per studiare le caratteristiche delle linee mutate sia in normali condizioni di crescita sia in condizioni di stress, e per chiarire ulteriormente il ruolo dell’enzima monodeidroascorbato reduttasi nel riciclo dell’acido ascorbico.