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• colture cellulari
• genome editing
• nanomedicina
• nanoparticelle

Le nanoscienze si occupano dello studio e della manipolazione dei fenomeni su scala macromolecolare, molecolare e atomica, livello in cui le proprietà differiscono significativamente da quelle che si ritrovano su scale maggiori.
In questo ambito, assumono un ruolo importante le nanotecnologie intese come la progettazione, la caratterizzazione, la produzione e l’applicazione di strutture e dispositivi per la manipolazione e il controllo di sistemi dell’ordine del nanometro (“nanoscala”). Un esempio di applicazione sono le nanoparticelle e il loro utilizzo a scopi biomedici. Tali unità strutturali vanno a modificare le caratteristiche della componente a queste legata, in termini di stabilità, localizzazione, efficienza e risposta a diversi stimoli fisici e chimici.
Le applicazioni in ambito biomedico delle nanoparticelle sono le più disparate, possono infatti andare ad aumentare la stabilità di una proteina o l’efficienza di un enzima, migliorare il trasporto di un composto all’interno di una cellula o favorirne la localizzazione specifica a livello tissutale, cellulare e subcellulare; inoltre possono essere utilizzate per il rilascio controllato di farmaci, inclusi acidi nucleici per protocolli di terapia genica. Inoltre, nel caso dell’utilizzo di nanoparticelle inorganiche, il rilascio è “attivabile”, in risposta a specifici stimoli che possono essere “trasdotti” dalle nanoparticelle (nanotrasduttori).
Il presente progetto di tesi ha come scopo quello di progettare una nuova nanoformulazione per terapia genica, composta da un nanotrasduttore, attivabile con un’appropriata radiazione elettromagnetica, legato ad un enzima capace di indirizzarlo ad uno specifico locus genico. Il mio lavoro è stato quello di mettere a punto il protocollo di coniugazione dell’enzima alla nanoparticella, caratterizzarne le proprietà strutturali e l’efficienza funzionale in vitro e in vivo. La prima fase è stata la coniugazione alla nanoparticella dell’enzima costituito dalla ribonucleoproteina gRNA:dCas9 progettato per riconoscere una sequenza target di 20 nucleotidi. La proteina dCas9 è espressa come proteina di fusione con un “Tag” di 6 istidine, e legata alla superficie del nanotrasduttore, a sua volta funzionalizzata con il ligando “NTA”. La concentrazione di proteina coniugatasi alla nanoparticella è stata caratterizzata tramite la tecnica del Dot Blot. Il diametro idrodinamico del complesso e le sue proprietà di superficie sono stati studiati tramite tecnica DLS (dynamic light scattering) e potenziale Z, rispettivamente.
Ho poi caratterizzato la biocompatibilità della nanoformulazione nelle cellule di melanoma A375 tramite il saggio colorimetrico MTT e ho stimato tramite analisi di regressione le dosi IC25 e IC50, cioè quelle che causano la morte del 25% e 50 % delle cellule in coltura. Successivamente, ho valutato la capacità del complesso di indirizzarsi al corretto target genico. A tale scopo ho legato al nanotrasduttore la forma cataliticamente attiva dell’enzima, la proteina Cas9, fornendo gli RNA guida opportuni per effettuare un taglio specifico su un frammento bersaglio e valutando il riconoscimento della sequenza target tramite analisi elettroforetica. Terminata la validazione in vitro, il complesso è stato testato nel sistema modello di zebrafish, indirizzando il complesso al gene della tirosinasi e valutando fenotipicamente l’evento di editing, in termini di depigmentazione dell’embrione. Infine, tramite l’utilizzo del microscopio a trasmissione elettronica (TEM), ho studiato l’internalizzazione e la localizzazione del complesso somministrato nel terreno di coltura di cellule di melanoma A375 allo scopo di studiare la capacità del vettore di attraversare la membrana cellulare e indirizzarsi spontaneamente nel nucleo.
Le nanoformulazioni che ho prodotto durante la mia esperienza in laboratorio mostrano aumentare la stabilità degli enzimi Cas9 e dCas9, e mantengono un’attività paragonabile a quella dell’enzima libero, sia in vivo che in vitro, dimostrando la loro capacità di indirizzare il nanotrasduttore ad uno specifico locus genico.