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Tesi etd-11202012-163653


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
ROSATI, ANTONELLA
URN
etd-11202012-163653
Title
Effetto probiotico di una miscela di batteri in ratti alimentati con dieta iperlipidica
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Dott. Longo, Vincenzo
relatore Dott.ssa Della Croce, Clara Maria
correlatore Dott.ssa Fierabracci, Vanna
correlatore Prof. Paolicchi, Aldo
Parole chiave
  • batteri
Data inizio appello
06/12/2012;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
06/12/2052
Riassunto analitico
La parola probiotico deriva dal greco pro bios, ovvero “per la vita” e si riferisce a microrganismi vitali che, quando somministrati in adeguate quantità, esibiscono un effetto benefico sulla salute dell’ospite migliorando le proprietà della microflora indigena. In generale, la concentrazione ottimale per riscontrare un’azione protettiva è compresa tra 10^7 e 10^12 unità formanti colonia (UFC)/ml e i batteri più comunemente associati con l’attività probiotica sono lattobacilli e bifidobatteri, componenti importanti della microflora gastrointestinale umana. Anche se non tutti i probiotici conferiscono gli stessi benefici all’ospite, i principali meccanismi d’azione con cui agiscono includono l’attività competitiva nei confronti dei batteri patogeni e la modulazione del sistema immunitario dell’ospite, sia innato che acquisito.
Un elevato apporto di acidi grassi liberi a livello epatico può modulare gli enzimi del drug metabolism ed innescare un processo infiammatorio. Quest’ultimo è mediato dall’attivazione del fattore di trascrizione NFkB che determina la sintesi di citochine pro-infiammatorie quali TNFα. In particolare, l’attivazione cronica della chinasi IKKβ, che attiva a sua volta il fattore NFkB, e la continua produzione di citochine pro-infiammatorie, determinano lo sviluppo di un meccanismo di insulino-resistenza che, in ultima analisi, può causare, in associazione ad un consistente accumulo di acidi grassi liberi, lo sviluppo di tutta una serie di anomalie e disfunzioni a livello epatico
Appropriati modelli animali, alimentati con dieta iperlipidica, sono un mezzo essenziale al fine di studiare i meccanismi che correlano un elevato introito di grassi con un possibile sviluppo di diverse patologie, quali la steatosi. In particolare, quelli più utilizzati sono i modelli nutrizionali che, a seconda dei casi, prevedono l’impiego di una dieta ricca di grassi e priva in metionina e colina (MCD), o una dieta ricca in colesterolo o, ancora, con alte dosi di saccarosio e fruttosio. In generale, nel modello sperimentale di ratti alimentati con dieta iperlipidica è stato messo in evidenza un aumento del peso dell’animale e del fegato, un’induzione della perossidazione lipidica e dell’espressione di TNFα, iNOS, COX-2 e una downregulation dell’espressione di PPARα rispetto agli animali alimentati con la sola dieta di mantenimento. La somministrazione di probiotici insieme ad una dieta iperlipidica riporta l’espressione dei suddetti parametri quasi ai livelli del controllo. Queste evidenze sperimentali suggeriscono che l’assunzione di probiotici può limitare il danno epatico ossidativo ed infiammatorio.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di investigare la potenziale funzione benefica di due specie batteriche, che non appartengono alla microflora intestinale, in ratti alimentati con dieta iperlipidica. Nello specifico, la procedura sperimentale è stata condotta in 2 fasi. Preliminarmente, allo scopo di valutare la tossicità acuta dei batteri in esame, è stato eseguito un esperimento della durata di 4 giorni utilizzando ratti suddivisi in tre gruppi (il primo di controllo, un secondo trattato con Bacillus amyloliquefaciens ed un terzo con Pseudomonas fluorescens). Questi batteri sono stati somministrati quotidianamente, attraverso una sonda gastrica, alla concentrazione di 10^9 UFC in un volume di 1 ml. I ratti sono stati sacrificati e sono stati asportati il fegato ed il colon. Nell’omogenato di colon e fegato sono stati dosati il glutatione e la perossidazione lipidica; nella frazione citosolica epatica sono state determinate le attività DT-diaforasi e catalasi, mentre nella frazione microsomiale sono state determinate alcune attività citocromo P450 dipendenti. I risultati delle attività enzimatiche hanno dimostrato che la somministrazione di questi batteri, nelle condizioni sopradette, non hanno prodotto effetti tossici. Pertanto, è stata impostata la seconda fase sperimentale al fine di valutare il potenziale effetto benefico di questi batteri nei confronti di ratti alimentati con una dieta iperlipidica contenente il 23% di grassi rispetto alla dieta di mantenimento contenente il 4% di grassi. Un primo gruppo di ratti (n=3) è stato alimentato con la dieta standard (controllo), un secondo (n=4) con la dieta iperlipidica ed un ultimo (n=4) con la stessa dieta iperlipidica e trattato quotidianamente con la miscela dei batteri precedentemente utilizzati, per 28 giorni alla concentrazione di 10^9 UFC in 1 ml. Su questi animali sono state eseguite i saggi descritti nella fase sperimentale precedente, l’analisi dell’espressione di geni che sono coinvolti nel metabolismo lipidico (FAS, CPT) e nella risposta infiammatoria (TNFα), tramite PCR Real-Time, ed esperimenti di western blotting per i fattori di trascrizione Nrf2 e NFkB.
I risultati ottenuti dal presente studio dimostrano che l’assunzione della dieta iperlipidica per 4 settimane ha innescato un processo infiammatorio e un’alterazione degli enzimi del drug metabolism. In particolare, è stato osservato un decremento significativo della concentrazione del glucosio ematico che farebbe pensare allo sviluppo di un meccanismo di insulino-resistenza. Un altro risultato interessante è la diminuzione significativa del contenuto di glutatione ridotto, che indica un incremento nella produzione di specie radicaliche dell’ossigeno a causa di un aumentata assunzione di grassi. Inoltre, è stato rilevato un aumento significativo delle attività di eme ossigenasi-1 e di alcune attività P450 dipendenti, quali ECOD e AnH. Per mettere in evidenza lo sviluppo di un processo infiammatorio, è stato quantificato il livello di trascritto relativo al gene che codifica per la citochina TNFα nel fegato e la traslocazione nucleare del fattore di trascrizione NFkB. I risultati ottenuti evidenziano un aumento significativo di entrambi i parametri.
La somministrazione della mix batterica (Bacillus amyloliquefaciens e Pseudomonas fluorescens) ha manifestato effetti protettivi nei confronti della dieta iperlipidica ripristinando la concentrazione del glutatione ridotto ai livelli del controllo, riducendo significativamente l’attività AnH e HO-1 e inibendo lo sviluppo di un processo infiammatorio.
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