• ibridazioni in situ
• immunoistochimica
• kidins220
• pdzrn3
• sviluppo
• Xenopus laevis

Kidins220 (kinase D-interacting substrate of 220 kDa), anche conosciuta con il nome di ARMS (ankyrin repeat-rich membrane-spanning), è una proteina transmembrana altamente conservata, espressa soprattutto in cellule del tessuto nervoso. Essa possiede multipli domini di legame, che permettono di interagire con vari recettori, enzimi e proteine diverse, partecipando alla formazione di specifici complessi multiproteici a livello delle membrane delle cellule neuronali. Dati sperimentali ottenuti recentemente presso il nostro laboratorio indicano che Kidins220 può interagire direttamente con Pdzrn3, una proteina con attività ubiquitina-ligasi, con la quale condivide alcuni domini di espressione.
Il mio lavoro di tesi si inserisce in un progetto di ricerca volto a studiare il ruolo di kidins220 e pdzrn3 durante lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis (Xl). A tale scopo ho effettuato la caratterizzazione del loro profilo di espressione a partire da stadi precoci di sviluppo (stadio 13, neurula precoce) fino agli stadi larvali più tardivi (stadio 42).
L’espressione del gene kidins220 è stata analizzata mediante tecniche sia di ibridazione in situ whole-mount con l’uso di sonde specifiche, sia di immunoistochimica con l’utilizzo di un anticorpo policlonale diretto contro la porzione carbossiterminale della proteina KIDINS220 umana, che presenta una forte omologia con quella di Xl. I risultati mostrano che kidins220 risulta espresso in differenti regioni embrionali, tra cui alcune di origine neurale, quali il nervo trigemino, la vescicola ottica, l’ipotalamo, il talamo, i motoneuroni, e altre di origine non-neurale, come i somiti, e l’epidermide. I risultati ottenuti hanno messo in luce una localizzazione compartimentalizzata della proteina Kidins220 in prossimità delle giunzioni intersomitiche già a partire dallo stadio 20 (6-7 somiti). Questo pattern si mantiene fino a stadi più tardivi (stadio 37-38, 40 somiti). Gli esperimenti di immunoistochimica sono stati eseguiti con il sistema di rivelazione DAB (3,3' diaminobenzidina) o con sistemi di doppia immunofluorescenza effettuati su embrioni interi, con l’utilizzo di marcatori specifici: l’anticorpo monoclonale muscolo-specifico Ab12/101, l’anticorpo monoclonale 6-11B-1 diretto contro la tubulina acetilata usato come marcatore di tessuto nervoso, l’anticorpo monoclonale 43DAG/8D5, diretto contro il distroglicano usato come marcatore delle giunzioni intersomitiche.
L’analisi di espressione del gene pdzrn3 è stata effettuata solo mediante tecniche di ibridazione in situ, non essendo per ora disponibile un anticorpo specifico per la proteina Pdzrn3 di Xl. Il messaggero di pdzrn3 condivide alcuni domini di espressione con kidins220, in quanto risulta espresso nella vescicola ottica, in varie regioni del sistema nervoso centrale, tra cui l’ipotalamo e nei somiti. Inoltre abbiamo riscontrato una notevole espressione, mai descritta in precedenza, a livello del pronefro e delle isole ematiche.
I risultati ottenuti permettono di estendere lo studio di questi due geni all’analisi del loro ruolo durante lo sviluppo, effettuando esperimenti di “perdita di funzione” mediante iniezione di oligonucleotidi antisenso “morpholino in embrioni a stadio di 2 cellule e successiva osservazione dei fenotipi.