• mitoticamente quiescenti

RIASSUNTO

Nei mammiferi la cisteina può essere assunta con la dieta o può essere sintetizzata a partire da metionina e serina nella via di transulfurazione. La metionina e la cisteina sono metabolicamente collegate attraverso il percorso unidirezionale della via di transulfurazione che usa la metionina come una risorsa di atomo di zolfo per la sintesi della cisteina. La metionina è il precursore dell’omocisteina amminoacido che collega la via di transmetilazione a quella di transulfurazione.
In presenza di adenosina trifosfato (ATP) l’enzima metionina adenosiltrasferasi transforma la metionina in S-adenosilmetionina e a sua volta successivamente idrolizzata in adenosina e omocisteina per azione di una adenosilomocisteinasi. A questo punto l’omocisteina può essere indirizzata nella via di transulfurazione o nella via di rimetilazione per risintetizzare la metionina. Nella via di transulfurazione l’omocisteina va a cisteina attraverso le reazioni catalizzate da due enzimi piridossal-5’-fosfato dipendenti (PLP), che sono la cistationina β-sintasi (CBS) e la cistationina γ-liasi (CGL). La CBS catalizza la condensazione di omocisteina e serina per formare la cistationina con una reazione irreversibile; la cistationina è quindi idrolizzata attraverso la CGL a dare cisteina, α -chetobutirrato e ammoniaca.
Rilevanti livelli di CBS sono stati individuati in diversi tessuti di ratto fra cui il pancreas, il fegato, il rene, l’ntestino, il cervello e il tessuto adiposo.
Recenti esperimenti evidenziano la presenza della via di transulfurazione in particolare dell’enzima CBS in cellule epiteliali di cristallino umane (HLE) quando sottoposte a stress ossidativo.
Obbiettivo della tesi è la valutazione della presenza di enzimi della via di transulfurazione in cellule epiteliali di cristallino bovino in coltura e il tentativo di un loro parziale isolamento.
Il lavoro sperimentale ha previsto la messa in coltura di cellule epiteliali di cristallino bovino a partire da espianti di capsule. Dopo due passaggi successivi in coltura le cellule sono state raccolte e sull’estratto grezzo è stata valutata la presenza degli enzimi CBS e CGL mediante saggi spettrofotometrici e Western blot.
L’enzima CBS è stato valutato mediante un saggio colorimetrico che prevede la formazione di cistationina a partire da omocisteina e serina; per quanto riguarda la CGL è stata valutata l’attività mediante saggi spettrofotometrici utilizzando due diversi substrati, la β-cloro-L- alanina (β-CA) e la cistationina.
I risultati evidenziano la presenza della via di transulfurazione in cellule epiteliali di cristallino ed in particolare dell’enzima CGL. Successivamente è stato messo a punto un primo tentativo di isolamento dell’enzima CGL mediante cromatografia a scambio ionico.