• agenti antimicrobici
• antimicrobial agents
• farmaco-resistenza
• drug resistance
• adesione batterica
• bacterial adhesion

TITOLO: Studio dell’attività antimicrobica dei peptidi naturali epcidina 20 e temporina B verso biofilm di Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis è considerato uno dei principali agenti patogeni nosocomiali, spesso coinvolto in infezioni correlate alla formazione di biofilm su dispositivi medici. I biofilm sono comunità microbiche sessili costituite da microrganismi che aderiscono a superfici solide biotiche, come cute e mucose, o abiotiche, come per esempio le superfici di protesi o cateteri. I microrganismi produttori di biofilm crescono avvolti da una matrice extracellulare di complessa natura che essi stessi producono e che influenza in larga misura le proprietà stesse del biofilm. La presenza della matrice extracellulare infatti, insieme ad altri fattori come il lento ritmo di crescita che caratterizza le cellule del biofilm, conferisce a quest’ultime un fenotipo altamente resistente ai comuni chemioantibiotici, rispetto agli stessi microrganismi in forma planctonica. Ciò rende il trattamento delle infezioni biofilm-correlate particolarmente difficoltoso tenuto anche conto che spesso, i ceppi nosocomiali coinvolti, risultano aver acquisito resistenze multiple ai comuni chemioantibiotici. Per tali ragioni, l’identificazione di nuove molecole attive sui biofilm microbici rappresenta, ad oggi, una priorità nel campo della ricerca di nuovi farmaci antinfettivi.
A tale riguardo, un grande interesse è stato suscitato negli ultimi anni dai peptidi antimicrobici (AMPs), piccoli peptidi (12-50 aminoacidi), generalmente cationici (carica netta da +2 a +11), prodotti da una grande varietà di cellule e tessuti ed altamente conservati nella scala evolutiva, dagli invertebrati ai mammiferi. Tali molecole sono spesso dotate di un ampio spettro d’azione, che include batteri, virus, funghi e protozoi, e rappresentano importanti mediatori della risposta immune innata alle infezioni. Il possibile uso degli AMPs quali agenti antibiofilm è un’area emergente di ricerca. Tali molecole presentano, infatti, caratteristiche che potrebbero rivelarsi utili nel trattamento dei biofilm microbici quali la capacità di agire anche su cellule metabolicamente poco attive o su microrganismi multiresistenti ai farmaci convenzionali. Un numero crescente di peptidi è stato saggiato su biofilm di specie batteriche o fungine clinicamente rilevanti ed ha presentato la capacità di interferire con varie tappe della formazione del biofilm. Nonostante ciò la conoscenza dettagliata del/dei meccanismi dell’attività antibiofilm degli AMPs è ancora ad uno stadio iniziale.
Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di studiare l’attività antibiofilm di due peptidi antimicrobici di diversa natura: l’epcidina 20 e la temporina B. Il primo peptide è prodotto dalle cellule epatiche dell’uomo, è di natura idrofilica e presenta una tipica struttura a foglietto beta stabilizzata da 4 ponti disolfuro; il secondo peptide è prodotto dalla cute di Rana temporaria, presenta una struttura ad alfa elica ed un elevato grado di idrofobicità. I due peptidi sono stati saggiati verso ceppi di S. epidermidis produttori di biofilm e caratterizzati genotipicamente e fenotipicamente relativamente alla produzione di matrice extracellulare.
L’attività antibiofilm è stata valutata in primo luogo su biofilm in formazione incubando per circa 20 ore batteri in fase stazionaria di crescita con dosi crescenti di entrambi i peptidi in piastre di polistirene da 96 pozzetti. Al termine del periodo di incubazione, la biomassa totale del biofilm (intesa come l’insieme delle cellule batteriche associate al biofilm e della matrice extracellulare) è stata quantificata mediante colorazione con cristal violetto, solubilizzazione con etanolo e lettura della densità ottica a 590 nm. L’eventuale effetto dei peptidi sul numero delle cellule vitali è stato valutato mediante conta del numero delle unità formanti colonia (CFU) dopo rimozione meccanica delle cellule adese ai pozzetti ed inoculazione delle stesse su terreno solido.
L’epcidina 20, saggiata in un intervallo di concentrazioni comprese tra 25 μg/ml e 100 μg/ml, ha causato una riduzione della biomassa totale del biofilm in maniera dose dipendente. E’ interessante notare che tale riduzione, era ottenuta a concentrazioni inferiori rispetto a quelle necessarie per inibire i batteri in forma planctonica (sub-MIC) suggerendo un meccanismo di inibizione biofilm-specifico. La riduzione della biomassa del biofilm non risultava però correlata alla riduzione del numero delle CFU associate al biofilm, indicando che il peptide possa avere un effetto inibitorio sulla produzione della matrice extracellulare.
La temporina B, invece, saggiata in un intervallo di concentrazioni comprese tra 12.5 μg/ml e 50 μg/ml, provocava una significativa riduzione della biomassa totale a concentrazioni corrispondenti o superiori a quelle della MIC, riduzione che correlava, a tali concentrazioni, con una marcata riduzione del numero delle cellule vitali associate al biofilm.
Dato l’effetto dimostrato dalla temporina B sulle cellule associate al biofilm si è voluto valutare se il peptide fosse in grado di ridurre anche il numero di cellule vitali in biofilm preformati, una proprietà ad oggi dimostrata solo per pochissimi AMPs o antibiotici convenzionali. L’incubazione del peptide alla concentrazione di 100 μg/ml con biofilm maturi di S. epidermidis ha causato una riduzione statisticamente significativa del numero dei batteri vitali associati al biofilm, anche se l’effetto battericida sembra essere influenzato dal ceppo batterico considerato.
In conclusione i risultati ottenuti nel presente lavoro di tesi dimostrano che l’epcidina 20 e la temporina B presentano un’azione antibiofilm in vitro verso ceppi di S. epidermidis. Tale attività antibiofilm potrebbe essere ascrivibile a differenti meccanismi inibitori esercitati dai due peptidi rispettivamente sulla produzione di matrice extracellulare (epcidina 20) e/o sul numero delle cellule vitali associate al biofilm (temporina B). Tali risultati rafforzano l’idea corrente che gli AMPs, utilizzati da soli od in combinazione con altre molecole ad attività antibatterica, possano rappresentare molecole promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci attivi sui biofilm microbici.