• activation
• attivazione
• due fotoni
• fluorescent protein
• fotocromismo
• photoactivatable
• photochromic
• proteina fluorescente
• reversibile
• reversible
• riattivazione
• two photon

La proteina EYQ1 è una proteina fluorescente fotocromica della famiglia delle YFP (proteine gialle fluorescenti) derivata per mutazioni a partire dalla GFP (green fluorescent protein) di Aequorea victoria. Le proprietà fotocromiche si esplicano nello spegnimento (bleaching) della fluorescenza per irradiazione a 515 nm e nella sua riattivazione per rapida irradiazione a 405 nm. Entrambi i processi sono reversibili e ripetibili un numero elevato di volte. Le proteine fluorescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocromiche (RSFP) come la EYQ1 possono essere utilizzate in tecniche avanzate di microscopia di fluorescenza su campioni biologici, essendo in grado di evidenziare con la loro attivazione aree ristrette e controllabili del campione. In questo modo sono rese più semplici, ad esempio, l'osservazione dell'evoluzione temporale di strutture cellulari o della diffusione di proteine a cui sono fuse le PAFP.

Le proprietà fotocromiche in condizioni di eccitazione a singolo fotone sono già state studiate. Nel presente lavoro di tesi sono presentati i risultati dell'analisi delle stesse proprietà in condizioni di eccitazione a due fotoni. Le tecniche di eccitazione a due fotoni presentano infatti il vantaggio di produrre un maggiore confinamento tridimensionale dell'attivazione.

Sono innanzitutto stati determinati gli spettri di eccitazione a due fotoni di EYQ1 in soluzioni acquose (nelle due forme in cui il cromoforo è anionico o neutro, rispettivamente). Successivamente, in esperimenti con la proteina immobilizzata in gel di poliacrilammide, è stata determinata la forma della banda di eccitazione a due fotoni da cui ha origine la riattivazione. La stabilità della proteina in sequenze di cicli ripetuti di spegnimento a singolo fotone e riattivazione a due fotoni, è stata valutata in esperimenti in gel e confrontata con i risultati di precedenti misure a singolo fotone. È stato inoltre valutato lo spessore verticale del volume riattivato a due fotoni in funzione del tempo totale di irradiazione.

Gli ordini di grandezza delle rese quantiche di bleaching reversibile e irreversibile a due fotoni sono stati stimati a partire da misure del decadimento di fluorescenza durante l'irradiazione della proteina immobilizzata su strati sottili di polivinil alcool (PVA).
Infine, sono stati effettuati esperimenti di riattivazione a due fotoni su cellule vive e fissate.

Dai risultati è emerso che il fotocromismo di EYQ1 è conservato anche in condizioni di eccitazione a due fotoni. Effettuando i cicli di spegnimento (a singolo fotone) e riattivazione (a due fotoni) a basse potenze, il comportamento di EYQ1 è risultato paragonabile rispetto al comportamento a singolo fotone. Effettuando bleaching e riattivazione più rapidamente e con potenze di irradiazione maggiori, la stabilità della proteina diminuisce, ma è sempre possibile effettuare un discreto numero di cicli. È stato notato che la potenza di irradiazione in fase di bleaching (a singolo fotone) influisce maggiormente sulla stabilità della proteina di quanto non faccia la potenza di irradiazione in fase di riattivazione (a due fotoni). Le osservazioni in vitro non sono state smentite dalle prove in vivo. È stato infine osservato che la localizzazione verticale della riattivazione è molto buona.

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Two-Photon Conversion of the Fluorescent Protein EYQ1

EYQ1 is a photochromic fluorescent protein from the family of the YFPs (yellow fluorescent proteins) derived by site-directed mutations from Aequorea victoria GFP (green fluorescent protein). The photochromic properties involve the switching off (bleaching) of its fluorescence by irradiation at 515 nm and the switching on by rapid irradiation at 405 nm. Both processes are reversible and repeatable many times. Photoactivatable (PAFPs) and reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs) like EYQ1 can be employed in advanced fluorescence microscopy techniques on biological samples, thanks to the fact that they can highlight with their activation restricted and controllable regions of the sample. By this way, for instance, monitoring the temporal evolution of cell structures and the diffusion of proteins to which PAFPs are fused, are made simpler.

Photochromic properties in single-photon excitation mode have already been studied. In this thesis work are presented results of an analysis of the same properties in two-photon excitation mode. Indeed, Two-photon excitation techniques have the advantage of producing a better three-dimensional confinement of excitation and, therefore, of activation.

Firstly, two-photon excitation spectra of EYQ1 (in both states with anionic or protonated chromophore, respectively) were determined in acqueous solutions. Subsequently, in experiments with immobilized proteins in a polyacrylamide gel, the shape of the two-photon excitation band from which reactivation originates was also determined. Stability and fatigue of the protein in repeated one-photon off-switching and two-photon on-switching were determined in experiments in gel and compared with previous single-photon experiments. Additionally, the vertical thickness of the two-photon reactivated volume was evaluated as a function of total irradiation time.

The orders of magnitude of two-photon reversible and irreversible bleaching were extimated from measurements of fluorescence decay under irradiation of the immobilized protein in thin layers of polyvinyl alcohol (PVA). Finally, two-photon reactivation experiments were carried on also on live and fixed cells.

From the results appears that EYQ1 photochromism is conserved also in two-photon excitation conditions. In one-photon off- and two-photon on-switching cycles at lower powers, EYQ1 behaviour resulted comparable to the single-photon activation case. Bleaching and reactivating at a higher speed and irradiation power results in a decrease of protein stability, though it is still possible to perform some cycles. It was noticed that the irradiation power in the single-photon (bleaching) phase affects protein fatigue more than does the irradiation power in the (two-photon) reactivation phase. In vitro observations were not contradicted by the in vivo experiments. Finally, the vertical localization of reactivation was observed to be very good.