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Nel presente lavoro di tesi magistrale è stato progettato, fabbricato e caratterizzato un dispositivo per colture cellulari dinamiche basato su onde acustiche di superficie (SAW).
Negli ultimi anni sono stati studiati metodi innovativi di coltura cellulare in vitro, i quali propongono condizioni di coltura differenti rispetto a quelle standard, nell'ottica di dare alle cellule stimoli più simili a ciò che sperimentano in vivo. Tra le varie strategie esplorate, sono state studiate colture in presenza di gradienti chimico-fisici (in presenza di flussi, per esempio) e in alcuni studi sono state utilizzate tecniche microfluidiche per il controllo spaziale e la manipolazione di piccoli volumi di liquidi (inferiori a 10-9 l)]. E' stato dimostrato come, tramite tecnologia microfluidica, le colture dinamiche, quelle in cui il mezzo di coltura è in moto, possono migliorare il differenziamento cellulare, il loro metabolismo o alterarne le funzioni. Tali ricerche dimostrano come le colture dinamiche siano preferibili rispetto a quelle statiche standard, e ciò ha creato un interesse sia commerciale che tecnologico per questa tipologia di sistemi.
Negli ultimi anni, le onde acustiche di superficie (SAW) hanno ricevuto un'attenzione significativa nella comunità della microfluidica, soprattutto nel campo dei lab-on-a-chip (LOC, dispositivi di piccole dimensioni utilizzati per diverse tipologie di analisi di laboratorio, tra cui le analisi diagnostiche). Le SAW sono oscillazioni meccaniche che si propagano lungo la superficie di un solido, le quali possono essere generate su materiali piezoelettrici usando dei trasduttori interdigitati (IDT), fabbricati depositando un film sottile di metallo sul substrato piezoelettrico. E' stato ampiamente dimostrato come le SAW possano essere utilizzate per effettuare la miscelazione e l'attuazione di fluidi, in microgocce o in microcanali, oltre che la manipolazione di microparticelle al loro interno, in dispositivi LOC miniaturizzati (con dimensioni comprese fra il mm2 e il cm2).
Per la miscelazione dei liquidi viene sfruttato il fenomeno dello “streaming acustico”. Quando la SAW entra in contatto con un fluido, l'energia acustica rifrange in esso a causa della differenza fra le velocità del suono nel substrato e nel liquido, ad un determinato angolo θR (detto “angolo di Rayleigh”), generando un'onda di pressione longitudinale all'interno del liquido. Tale onda induce un moto netto del fluido, definito come streaming acustico, che può portare a una rapida miscelazione anche nel caso di regimi di bassi numeri di Reynolds in cui il flusso del fluido è laminare.
Le funzionalità microfluidiche delle SAW sono state sfruttate per varie tipologie di applicazioni su cellule. Un dato importante emerso da tali studi è la biocompatibilità delle SAW. In questo lavoro di tesi è stato realizzato un dispositivo per effettuare colture cellulari dinamiche sfruttando le SAW. Esso è stato realizzato in modo che fosse semplice da usare, dalle dimensioni contenute, compatibile con microscopi ottici standard, incubatori e piastre di coltura attualmente utilizzate nei laboratori di biologia.
Il dispositivo è stato fabbricato a partire da un substrato in niobato di litio, al di sopra del quale sono stati realizzati degli IDT in oro tramite processi di litografia ottica. Glicerolo e un dischetto in polidimetilsilossano (PDMS) sono stati testati come mezzi di accoppiamento acustico tra il dispositivo e la coltura cellulare. Applicando una radiofrequenza agli IDT viene generata la SAW sulla superficie del cristallo. Questa rifrange nel mezzo di accoppiamento generando un'onda longitudinale che si propaga fin nel mezzo di coltura contenuto nella piastra Petri, mettendolo in moto attraverso lo streaming acustico. Il dispositivo è stato caratterizzato elettricamente, tramite un analizzatore di rete vettoriale, e meccanicamente mediante un vibrometro laser a effetto Doppler. Prima dell'uso del dispositivo su diverse linee cellulari, sono stati studiati la fluidodinamica indotta dallo streaming acustico nel mezzo di coltura (attraverso un'analisi di micro particle image velocimetry, µPIV ) e il riscaldamento indotto (tramite l'uso di una termocamera a infrarossi). Il dispositivo è stato testato su diverse linee cellulari (cellule umane tumorali della cervice uterina HeLa, cellule endoteliali di topo bEnd3, monociti umani U-937, embrioni di topo) e il suo effetto è stato valutato tramite test di vitalità, proliferazione e mediante imaging per valutare la morfologia cellulare.
E' stata verificata la biocompatibilità delle SAW su tutte le linee cellulari testate e sugli embrioni e, nel caso dei monociti U-937, è stato dimostrato un aumento della proliferazione cellulare, circa del 40% rispetto ai controlli posti in condizioni di coltura statiche standard. Questo risultato è il primo ottenuto nel caso di una coltura dinamica basata su SAW, confermando l'importanza dell'aspetto dinamico delle colture e affermando la novità dell'uso della tecnologia SAW a tale scopo.