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Tesi etd-11182016-103757


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM6
Author
DI STEFANO, IOSE'
URN
etd-11182016-103757
Title
Correlazioni tra profilo esomico-trascrittomico e prognosi nel glioblastoma.
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Commissione
relatore Prof. Naccarato, Antonio Giuseppe
Parole chiave
  • NextGenerationSequencing
Data inizio appello
06/12/2016;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
06/12/2019
Riassunto analitico
Il presente studio nasce da una collaborazione tra l’Anatomia Patologica di Pisa e la Fondazione Pisana per la Scienza - FPS di Pisa. <br>Il principale obiettivo di tale progetto è quello di caratterizzare molecolarmente il glioblastoma primario e cercare di contribuire alla comprensione dei meccanismi che regolano la progressione neoplastica, al fine di identificare biomarcatori sensibili e specifici che possano avere valenza prognostica e/o predittiva sia nell’ambito della prima diagnosi che nel follow-up di questa temibile neoplasia.<br>Il glioblastoma rappresenta la neoplasia maligna cerebrale primitiva più frequente, costituendo da solo oltre la metà dei gliomi, nonché quella più aggressiva. Tipicamente insorge durante la V e VI decade di vita, e si localizza più spesso a livello degli emisferi cerebrali. Pur essendo un tumore sicuramente non comune (l’incidenza è di circa 3-4casi per 100.000 abitanti/anno), l’altissimo tasso di mortalità che lo contraddistingue lo rende una problematica sanitaria di grande rilievo: ad un anno dalla diagnosi infatti la sopravvivenza risulta inferiore al 50%, ed è di poco superiore al 3% a 3 anni.<br>I protocolli terapeutici attuali prevedono una resezione chirurgica, quando possibile, della maggiore quantità asportabile della neoplasia, seguita quindi da radioterapia e chemioterapia adiuvanti: tale regime terapeutico è stato capace in epoca recente di incrementare la sopravvivenza media dei pazienti da 12,1 mesi a 14,6 mesi, e di portare ad una sopravvivenza globale a 2 anni dalla diagnosi del 26%, tuttavia le caratteristiche biologiche di questo di tumore (la rapidità di crescita e la spiccata capacità d’invasione dei tessuti circostanti in particolare) non consentono ancora di ottenere risultati soddisfacenti. Allo stato attuale, il glioblastoma resta dunque una patologia fondamentalmente incurabile.<br>Uno studio accurato dei meccanismi molecolari che causano tale progressione nel glioblastoma potrebbe dimostrarsi fondamentale per fornire importanti informazioni sulla sua biologia, informazioni da poter successivamente utilizzare a scopo prognostico e terapeutico. Nel caso del glioblastoma, tuttavia, studi di questo tipo risultano molto complessi, essenzialmente per la difficoltà di reperire quantità rappresentative di tessuto tumorale: occorre sottolineare come si parli comunque di una neoplasia non comune, spesso non completamente resecabile in sede chirurgica, e della quale in sede di analisi istopatologica non di rado si ottengano solo minuti frammenti bioptici, con scarsa componente tumorale.<br>Nel presente studio ci siamo proposti di ottenere nuove e più accurate informazioni sul comportamento biologico del glioblastoma attraverso l’identificazione di specifiche alterazioni molecolari e genetiche, nel tentativo di capire come queste possano, in qualche modo, influenzare la risposta alla terapia, la prognosi, la durata dell’intervallo libero da malattia prima della recidiva e la sopravvivenza globale. Per fare ciò ci siamo avvalsi delle più moderne tecnologie di sequenziamento, quali metodiche di Next Generation Sequencing (NGS), in grado di processare in una singola reazione numerosissime sequenze di DNA o RNA, mantenendo tempi e costi contenuti. Le potenzialità di queste nuove metodiche sono enormi, in particolare lo studio dell’intero trascrittoma umano e dell’esoma, che rappresentano probabilmente le applicazioni più importanti.<br>Per lo studio abbiamo selezionato 13 campioni tumorali di glioblastoma, tutti precedentemente diagnosticati come glioblastomi (grado IV WHO) verosimilmente primitivi, in assenza di precedenti storici di lesioni di grado minore.<br>I campioni sono stati scelti in modo da ottenere 3 gruppi/tipologie di casi, contraddistinti da una sostanziale differenza nel tempo della prima recidiva dopo la chirurgia (Relapse Free Survival - RFS): <br>- 6 casi con RFS inferiore o uguale a 5 mesi (Short RFS);<br>- 3 casi con RFS compreso tra 16 e 23 mesi (Medium RFS);<br>- 4 casi con RFS maggiore o uguale a 25 mesi (Long RFS).<br>Tutti i campioni sono stati caratterizzati dettagliatamente dal punto di vista molecolare. Inizialmente è stata caratterizzata la presenza di alcune alterazioni, solitamente assai frequenti nel glioblastoma: <br>- mutazione R132H nel gene IDH1, la cui assenza è servita ad escludere la secondarietà delle lesioni;<br>- status metilazionale del promotore del gene MGMT; <br>- presenza di amplificazione del gene EGFR e presenza della sua forma tronca (variante vIII).<br>La ricerca della mutazione R132H di IDH1, come accennato, è stata fondamentale per confermare la natura primitiva dei glioblastomi presi in considerazione per lo studio, alla luce delle più recenti (Maggio 2016) indicazioni fornite in questo senso dall’Organizzazione Mondiale della Sanità – OMS (World Health Organization – WHO).<br>Successivamente, al fine di individuare profili di espressione genica, è stato sequenziato il materiale genetico proveniente dalle neoplasie, in particolare l’intero trascrittoma dei campioni selezionati. <br>Nonostante la tipologia (e spesso la scarsità) del materiale (tessuti tumorali fissati in formalina ed inclusi in paraffina), è stato possibile ottenere, con questa nuova metodica, un’ottima performance di reazione.<br>Il presente studio ha consentito finora:<br>- l’identificazione di diversi marcatori molecolari, correlati con il tempo della prima recidiva ed in grado di fungere da fattore predittivo. In particolare sono state evidenziate differenze di espressione statisticamente significative in 172 geni, diversamente distribuiti nei 3 gruppi;<br>- è stato inoltre possibile identificare specifici processi biologici e vie genetico-molecolari nei quali sono coinvolti i geni identificati. Dato molto importante da mettere in evidenza, il maggior numero di geni differentemente espressi si trova nei due gruppi estremi, ovvero il gruppo Long RFS e il gruppo Short RFS: tali geni sono coinvolti in meccanismi cellulari anche molto diversi tra loro;<br>- di porre le basi per una nuova classificazione molecolare dei glioblastomi, che correli con la prognosi e consenta una personalizzazione degli schemi terapeutici (cosa che già accade, almeno in parte, per i carcinomi mammari). <br>Il presente lavoro ha inoltre ulteriori prospettive:<br>- validare i biomarcatori molecolari identificati con le tecniche di NGS, mediante ulteriori metodiche di sequenziamento (real-time PCR e sequenziamento di Sanger);<br>- aumentare la numerosità del campione; nonostante le difficoltà sopradette, tale limite potrà essere superato proprio grazie a queste nuove metodiche di sequenziamento che permettono di utilizzare materiale di routine o d’archivio, ampiamente a disposizione dei patologi;<br>- creare delle linee cellulari che esprimano in maniera selettiva i geni individuati, in modo da poter essere utilizzate come modelli per saggiare in vitro la chemiosensibilità agli attuali trattamenti o testarne di nuovi;<br>- identificare le eventuali proteine tradotte dai trascritti di fusione, per comprenderne il ruolo nel processo neoplastico, ed eventualmente utilizzarle come target terapeutico;<br>- identificare e validare tali biomarcatori da applicare in test diagnostici molecolari con valore prognostico e predittivo.<br>
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