• MDM2
• p53

Riassunto

Le neoplasie sono malattie clonali dovute ad una o più mutazioni e alterazioni dei meccanismi di riparazione atti a mantenere l'omeostasi cellulare. La perdita di tali meccanismi regolatori intracellulari causa un'incontrollata proliferazione cellulare. Nonostante non siano al momento del tutto chiari i molteplici meccanismi alla base dell'insorgenza, proliferazione e crescita tumorale, è senz'altro accertato il ruolo svolto da mutazioni responsabili dell'attivazione di oncogeni e dell'inattivazione di geni oncosoppressori. Nell'ambito dei geni oncosoppressori, p53 svolge un ruolo cruciale nella regolazione del ciclo cellulare. Esso infatti, in seguito al danno al DNA, determina il blocco del ciclo cellulare in fase G1 per permettere ai sistemi di riparazione di recuperare il danno; oppure, se il danno è irreparabile, l'attivazione della morte cellulare apoptotica. In tumori quali ad esempio i carcinomi del colon, il cancro alla mammella, i tumori neurogenici e in alcuni casi di linfoma è stata riscontrata l’inattivazione di p53 che può essere causata o da mutazioni o da una mancata regolazione da parte di proteine regolatorie. L'attività di p53 è infatti finemente regolata affinchè si possa realizzare una corretta omeostasi cellulare. In particolare la sovraespressione di proteine capaci di regolare p53 e quindi inibirne l'attività, quali la proteina MDM2 o ubiquitina-ligasi, determina un aumento dell'attività proliferativa delle cellule.
Una delle strategie che si è sviluppata in questi ultimi anni è ripristinare la capacità di p53 di modulare l'omeostasi cellulare attraverso la progettazione e sintesi di farmaci selettivi che possano inibire la formazione del complesso p53-MDM2. Recentemente sono state introdotte in fase clinica piccole molecole chiamate nutline che si sono dimostrate in grado di legarsi fortemente al sito di interazione tra p53 e MDM2 e, consentendo il rilascio di p53 dalla sua proteina regolatrice negativa, ne permettono l'attivazione della funzione di oncosoppressore.
Su questa base nel presente lavoro di tesi sono state saggiate, per la loro capacità di indurre morte in linee tumorali, molecole appartenenti alla famiglia delle spiro(ossindol-3-3'-tiazolidine) che, da studi di risonanza magnetica nucleare (NMR) condotti sul complesso p53-MDM2 ricostituito in vitro con proteine ricombinanti umane, hanno evidenziato una buona capacità di dissociare p53 da MDM2. In particolare tali molecole sono state valutate in grado di indurre morte di cellule di glioblastoma multiforme umano (GBM), uno dei tumori più resistenti alla chemioterapia. La linea linea cellulare di GBM umano U87MG è stata scelta in quanto sovraesprime MDM2 e esprime p53 senza alterazioni della sequenza aminoacidica.
Le cellule U87MG sono state trattate a diversi tempi (12h, 24h, 48h e 72h) in assenza e in presenza di concentrazioni variabili dei composti in esame e sottoposte a saggi di vitalità (esclusione del colorante Trypan Blue) e saggi di proliferazione (impiego del reagente sale di metiltetrazolio).
I dati ottenuti hanno dimostrato la capacità dei composti di indurre morte cellulare in cellule U87MG. I composti più efficaci sono stati utilizzati a concentrazioni pari alla loro IC50 per verificare la loro capacità di interagire direttamente col complesso p53-MDM2. E’ stata studiata l'attivazione di specifici segnali di morte, propri dell'apoptosi mitocondrio-dipendente. In particolare è stata valutata l'alterazione del potenziale di membrana mitocondriale mediante analisi citofluorimetrica e la presenza nel citosol del citocromo c. E’ stata valutata inoltre la frammentazione del DNA come evento finale di morte per apoptosi.


Cristina Luciani