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• probiotici
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RIASSUNTO
La steatosi è una delle patologie epatiche più diffuse nell’uomo. É caratterizzata da accumulo di grassi liberi, principalmente sotto forma di trigliceridi, e comporta una serie di danni che possono condurre in ultima analisi alla necrosi e all’apoptosi cellulare. Le cause che determinano questo accumulo sono di diversa natura (obesità, diabete, eccessivo consumo di alcol, malattie metaboliche): a seconda che la causa sia o meno un’elevata assunzione di alcol, distinguiamo la steatosi epatica alcolica da quella non alcolica (NAFLD). La NAFLD è una condizione che può essere reversibile e non sempre causa un danno epatico grave, ma in una piccola percentuale di casi l’eccesso di grasso determina lo sviluppo di infiammazione nel fegato fino alla condizione di steatoepatite non alcolica (NASH), caratterizzata da fibrosi e lesioni epatocitarie. Nella patogenesi della NAFLD/NASH un chiaro ruolo è svolto dal microbiota intestinale poiché il fegato, importante sito per la clearance e la fagocitosi batterica, è costantemente esposto a metaboliti e frazioni batteriche di derivazione intestinale. Data questa associazione, i probiotici potrebbero rivelarsi un efficace strumento per il trattamento della steatosi epatica. Il termine probiotici si riferisce a microrganismi vitali che, quando somministrati in adeguate quantità, apportano beneficio alla salute dell’ospite migliorando le proprietà della microflora endogena. Anche se non tutti i probiotici conferiscono gli stessi benefici all’ospite, i principali meccanismi con cui agiscono sono la modulazione della composizione del microbiota intestinale e la modulazione del sistema immunitario dell’ospite, sia innato che acquisito. La concentrazione ottimale per ottenere un effetto benefico è compresa tra 10^7 e 10^12 unità formanti colonia (UFC)/ml. Sebbene i batteri più comunemente associati con l’attività probiotica (lattobacilli e bifidobatteri) siano tipici della microflora gastrointestinale umana, è noto che anche batteri esogeni possono avere un ruolo probiotico.
Vari modelli animali di steatosi sono stati approntati per studiare i meccanismi di sviluppo della NAFLD e testare potenziali farmaci per il trattamento di tale patologia. I modelli più usati sono quelli che prevedono l’utilizzo di animali resi diabetici (geneticamente o con streptozotocina) o quelli nutrizionali, che si basano sulla somministrazione di diete particolari (dieta ricca di grassi, ricca in colesterolo, con alte dosi di saccarosio e fruttosio, ecc.).
Recentemente, per lo studio degli effetti protettivi di vari agenti (farmaci, sostanze naturali) è stato descritto un nuovo modello di steatosi, che prevede il trattamento con dieta iperlipidica in ratti resi diabetici (diabete di tipo 2) con bassa dose di streptozotocina (35 mg/kg). La particolarità di questo modello risiede nel fatto che, rispetto a modelli di sola dieta iperlipidica o solo diabete, riproduce in maniera più fedele il processo di patogenesi della NAFLD nell’uomo.
Tuttavia questo modello ha trovato fino ad ora pochi esempi in letteratura, nei quali sono stati trattati vari aspetti ma non è mai stato effettuato lo studio della modulazione degli enzimi del drug metabolism e un’approfondita analisi dell’attività degli enzimi coinvolti nella risposta antiossidante. Vista la rilevanza di questi aspetti nella steatosi epatica il principale scopo di questa tesi è stato la caratterizzazione in tale direzione del suddetto modello sperimentale, e la valutazione del potenziale effetto probiotico di una miscela costituita da Bacillus amyloliquefaciens e Pseudomonas fluorescens. Questi due microrganismi hanno alcune caratteristiche che lasciano supporre un loro ruolo probiotico, come l’assenza di tossicità in modelli animali (verificata da un recente studio condotto dal presente gruppo di ricerca).
La fase di trattamento in vivo, durata 8 settimane, è stata condotta su ratti maschi Wistar (n=15) suddivisi in 3 gruppi sperimentali: gruppo di controllo (n=5) alimentato con dieta standard (11% delle calorie derivanti da grassi); gruppo di ratti resi diabetici (STZ 35 mg/kg) e alimentati con dieta iperlipidica (55% delle calorie derivanti da grassi); gruppo di ratti resi diabetici, alimentati con dieta iperlipidica e trattati con la miscela batterica. La miscela è stata somministrata durante le ultime 4 settimane di trattamento, quotidianamente, per os attraverso sonda gastrica, alla concentrazione di 10^9 UFC in volume di 1 ml.
Al termine delle 8 settimane i ratti sono stati sacrificati, è stato stato asportato il fegato e prelevati campioni di sangue su cui sono stati misurati alcuni parametri ematici (AST, ALT, glucosio, trigliceridi, colesterolo totale, LDL, HDL). Sul tessuto epatico sono state effettuate la quantificazione dei lipidi e l’analisi istologica. Nei campioni di fegato sono stati dosati glutatione e perossidazione lipidica, sono state determinate alcune attività citocromo P450 dipendenti, l’attività dell’enzima eme ossigenasi-1 e varie attività antiossidanti (DT-diaforasi, superossido dismutasi, catalasi, glutatione reduttasi e glutatione perossidasi). Tramite PCR real-time è stata effettuata l’analisi dell’espressione genica di due geni chiave della risposta infiammatoria (TNFα, IL-6) e del fattore trascrizionale SREBP1c coinvolto nella lipogenesi. Mediante Western blotting è stata eseguita la valutazione immunologica dei livelli apoproteici di alcune isoforme di citocromo P450.
Dalla quantificazione dei lipidi epatici e dall’analisi istologica emerge che il trattamento ha indotto steatosi epatica ad uno stadio iniziale, nel quale non si ha un conclamato effetto infiammatorio né di stress ossidativo. Dai risultati ottenuti si osserva che il modello di steatosi e diabete utilizzato porta ad una modulazione dell’attività del sistema monossigenasico del citocromo P450, con induzione delle isoforme CYP2E1 e CYP3A e riduzione dell’attività dell’isoforma CYP2C11. Il modello invece non è associato ad una significativa modulazione dei principali enzimi antiossidanti.
Durante questo progetto è stato valutato il potenziale effetto protettivo della miscela di batteri costituita da Bacillus amyloliquefaciens e Pseudomonas fluorescens nei confronti della steatosi epatica; contemporaneamente, un altro gruppo di ricerca sta conducendo uno studio per l’analisi del microbiota e per verificare la presenza e la vitalità dei batteri a livello intestinale in ratti a cui è stata somministrata la sola miscela batterica. In attesa di questi risultati, dal presente studio è possibile concludere che la somministrazione della miscela batterica non ha influito sui parametri analizzati e quindi non ha mostrato effetto protettivo sul fegato.