• BRCA1
• carcinoma alla mammella ereditario
• EEF1E1
• hSSB1
• ricombinazione omologa

Il tumore alla mammella è la neoplasia più frequente nelle donne.
Il 20% dei casi è di origine familiare e il 40% di questi è dovuto a mutazioni patogenetiche
nei geni BRCA1 e BRCA2. Sebbene siano stati identificati altri geni di suscettibilità ad alta
penetranza, la maggior parte della suscettibilità genetica a questo tumore è attribuibile ad
un modello poligenico in cui varianti, sia polimorfismi che mutazioni, in un largo numero di
geni, anche se singolarmente associate ad un basso rischio, contribuiscono insieme alla
predisposizione allo sviluppo del tumore.
BRCA1 e BRCA2 codificano per delle proteine che sono implicate nella trascrizione
genica, nella stabilità genomica e nel riparo del DNA. Il mio progetto di tesi si è focalizzato
sul coinvolgimento del gene BRCA1 nel riparo del DNA ed in particolar modo nel processo
di riparo delle rotture a doppia elica del DNA (DSB) mediato dal meccanismo di
ricombinazione omologa.
In un lavoro svolto in precedenza nel laboratorio mediante tecnologia microarray (Agilent
44K Whole Human Genome Oligo Microarray), erano stati confrontati, i profili di
espressione genica di cellule HeLa trasfettate transientemente con due varianti di
BRCA1(M1775R, A1789T), di cui una classificata come patogenetica e l’altra di significato
patogenetico sconosciuto, con il profilo di espressione ottenuto dalla trasfezione di BRCA1
wt. L’ipotesi era che l’overespressione, seppure transiente, di forme mutate del gene
BRCA1 potesse produrre un differente profilo di espressione genica nelle cellule HeLa
rispetto alla forma wt. Sono stati così individuati numerosi geni sovra- e sotto-espressi ed i
più interessanti validati in RT-PCR ed in Western Blot. Tra questi sono stati selezionati
quelli coinvolti nella riparazione del DNA.
La mia tesi si focalizza su due di questi possibili geni partner di BRCA1 (BGP): hSSB1 e
EEF1E1.
HSSB1, la cui espressione risultava aumentata nella variante A1789T, codifica per una
single strand DNA-binding protein che partecipa al riparo delle rotture a doppio filamento
di DNA e al pathway di attivazione di ATM
EEF1E1, la cui espressione risultava ridotta nella stessa variante A1789T, codifica per un
fattore associato al complesso tRNAsintetasi anche importante per il processo di
attivazione di TP53 mediante la via di ATM/ATR in risposta al danno al DNA .
In primo luogo abbiamo voluto osservare se la frequenza di ricombinazione venisse alterata silenziando l'espressione di questi geni. Per fare ciò abbiamo silenziato i geni con
degli specifici siRNA in cellule HeLa. Le cellule utilizzate contengono un particolare
costrutto -hprtDRGFP che permette di valutare gli eventi di ricombinazione omologa e
misurarli tramite analisi di fluorescenza utilizzando il FACS o il semplice conteggio delle
cellule fluorescenti al microscopio. Abbiamo osservato che la frequenza di ricombinazione
valutata si riduceva del 27,7% in seguito al silenziamento sebbene parziale del gene
hSSB1 e del 41,7% per EEF1E1 rispetto ai controlli positivi (siRNA per il gene HPRT) e ai
controlli negativi (Screamble Negative Control Duplex).
Questi risultati erano indicativi del possibile coinvolgimento di questi due geni nel pathway
del riparo al DNA cui partecipa anche BRCA1. Per questo motivo ho voluto verificare se
questi due geni fossero target di mutazioni inattivanti in casi familiari di carcinoma
mammario negativi per le mutazioni dei geni BRCA1 e BRCA2.
Per svolgere questo tipo di indagine ho selezionato un gruppo di 39 probandi da famiglie
ad alto rischio (calcolato tramite il software BOADICEA e BRCAPRO), wild type per
BRCA1 e BRCA2 e affette da tumore alla mammella. L'analisi è stata condotta attraverso
PCR e sequenziamento diretto.