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Ilaria Giusy Scarfone

COSTRUZIONE DI UN SISTEMA DI CONTROLLO NEL SILENZIAMENTO COSTITUTIVO E CONDIZIONALE DELLA cN-II E VALUTAZIONE PRELIMINARE DEGLI EFFETTI DEL SILENZIAMENTO INDUCIBILE.


La 5'-nucleotidasi citosolica (cN-II), una delle sette 5'-nucleotidasi conosciute nei mammiferi, è un enzima citosolico distribuito in modo ubiquitario nei diversi tessuti, ma prevalentemente attivo nei tessuti con un turnover di acidi nucleici più dinamico. La sua sequenza aminoacidica risulta altamente conservata nel corso dell'evoluzione, ma molto diversa da quella degli altri membri della famiglia delle 5'-nucleotidasi.
La cN-II presenta un'attività specifica per i nucleotidi 6-ossipurinici, in particolare per l'IMP e il GMP e i suoi deossiderivati. Il meccanismo di reazione prevede la defosforilazione del nucleotide substrato con formazione di un intermedio covalente enzima-fosfato, ed il successivo trasferimento del fosfato a una molecola d'acqua (reazione fosfatasica) oppure a un nucleoside accettore in posizione 5' (reazione fosfotransferasica)1. Il meccanismo di catalisi, così come la presenza di tre particolari motivi conservati, sono caratteristici della superfamiglia delle HAD, cui l'enzima appartiene2.
La regolazione della cN-II è complessa: l'enzima è attivato da ATP, ADP, BPG, decavanadato, Ap4A, polifosfati e alte concentrazioni di KCl; alte concentrazioni di fosfato inorganico, invece, hanno un effetto inibitorio. Inoltre l'enzima necessita di Mg2+ per la sua attività3.
Il ruolo fisiologico della cN-II è, ad oggi, in corso di caratterizzazione. L'enzima partecipa al ciclo delle ossipurine ed è coinvolto, quindi, nella regolazione della concentrazione intracellulare dei pools nucleotidici e di fosforibosilpirofosfato (PRPP). Il PRPP è mantenuto a basso livello in condizioni normali, quando la cNII è pienamente attiva, onde evitare inutile recupero o sintesi di nucleotidi; in condizioni ischemiche, invece, l'attività della cN-II decresce e il PRPP è reso disponibile per la via di recupero o di sintesi de novo dei nucleotidi4.
La capacità della cN-II di fosforilare analoghi dei nucleosidi, usati come farmaci antitumorali e antivirali, suggerisce che una piena comprensione dell'attività dell'enzima potrà contribuire al futuro successo di terapie basate su di essi. L'interesse terapico allo studio della cN-II è motivato anche dal fatto che alterazioni dell'attività enzimatica sono state evidenziate in pazienti affetti dalla sindrome di Lesch-Nyhan5 e in cellule tumorali.
L'attività della cN-II sembra essere fondamentale per le cellule umane; esperimenti di silenziamento dell'enzima con tecniche di RNAi innescano il meccanismo apoptotico in diversi tipi di cellule6 e l'overespressione diminuisce la vitalità cellulare7.
Nel gruppo in cui ho svolto il mio internato di tesi è stato messo a punto un sistema di silenziamento costitutivo della cN-II, per mezzo del vettore pLVTHM, nel quale è stato inserito lo short hairpin RNA 661 ed è in corso la costruzione di un sistema silenziante la cN-II in modo inducibile, con il clonaggio dello stesso short hairpin nel vettore pLVCT-tTR-KRAB8. Il mio lavoro di tesi mira a completare i suddetti sistemi attraverso l'inserimento di uno short hairpin di controllo nello stesso vettore plasmidico pLVTHM e nel vettore pLVCT-tTR-KRAB. L'oligonucleotide di controllo presenta alle estremità i siti di restrizione MluI e ClaI, necessari per il clonaggio in pLVTHM. Per quello in pLVCT-tTR-KRAB si sfruttanto, invece, i siti di restrizione MscI e FspI. La presenza dello short hairpin di controllo nei vettori è stato verificato mediante l'analisi dei pattern di restrizione e confermato poi con il sequenziamento dei plasmidi.
Lo studio sugli effetti del silenziamento della cN-II viene condotto su cellule di astrocitoma umano (ADF), pertanto è necessario valutare l'assenza di eventuali alterazioni nell'espressione del prodotto trascrizionale e traduzionale della cN-II e di altre proteine umane. Dato che il silenziamento costitutivo dell'enzima induce in apoptosi le colture cellulari senza apportare alterazioni di sorta ai pools dei nucleotidi e dei nucleosidi intracellulari, è in programma la valutazione preliminare degli effetti del silenziamento condizionale della cN-II in colture cellulari ADF.

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1 Baiocchi et al; 1996
2 Allegrini et al; 2004
3 Pesi et al; 1998
4 Ipata e Tozzi; 2006, Barsotti;2003
5 Pesi et al; 2000
6 Careddu et al; 2008
7 Rampazzo; 2003
8 Szulc and Aebischer; 2008