• Transtiretina (TTR); Amiloidosi da TTR wild Type;

La proteina transtiretina (TTR) è una proteina sintetizzata a livello epatico e nei plessi corioidei e immessa rispettivamente in circolo e a livello del fluido cerebrospinale. La sua conformazione nativa è rappresentata da un omotetramero (55 kDa) derivante dall’associazione di due omodimeri (37 kDa). La sua funzione fisiologica in circolo è di trasportare l’ormone tiroideo tiroxina (T4) e la proteina legante il retinolo (RBP) grazie alla presenza di tasche di legame che si realizzano nella struttura del tetramero.
L’interesse per lo studio della TTR, negli ultimi anni, sta diventando sempre maggiore in quanto si è visto essere coinvolta nell’insorgenza di una condizione patologica nota come amiloidosi da TTR, associata al deposito tissutale di questa proteina in forma fibrillare.
Mutazioni in grado di generare varianti strutturali della proteina TTR possono favorire l’insorgenza di condizioni patologiche associate a deposito amiloide come la polineuropatia amiloide familiare (FAP, Familial Amyloid Polineuropathy) e la cardiomiopatia amiloide familiare (FAC, Familial Amyloid Cardiomiopathy). Sempre più interesse suscita l’amiloidosi da TTR wild-type, precedentemente conosciuta come amiloidosi senile sistemica (SSA, Senile Systemic Amyloidosis), per la quale ancora non sono noti i meccanismi che destabilizzano la struttura tetramerica della proteina wild type favorendo la formazione di fibrille insolubili.
Il meccanismo amiloidogenico delle proteine TTR mutate è noto: la forma nativa tetramerica, in conseguenza alla ridotta stabilità, tende a dissociarsi nelle sue componenti dimeriche, le quali a loro volta si dissociano in monomeri che sono in grado di aggregarsi e di generare degli oligomeri altamente amiloidogenici.
Il mio progetto verte principalmente sulla caratterizzazione della proteina TTR circolante, in particolare ho cercato di mettere a punto delle tecniche di analisi biochimiche per lo studio della proteina nativa e di tutte le sue possibili forme presenti in circolo. Tutti gli studi sono stati eseguiti scegliendo campioni di plasma di soggetti sani o di soggetti con amiloidosi da TTR.
Il metodo elettroforetico mi ha permesso di individuare e descrivere le molteplici forme di aggregazione della proteina TTR presenti nel plasma. L’analisi in elettroforesi nativa in gel in di poliacrilammide 4-20% si è rivelata avere una maggiore capacità nel separare gli aggregati ad alto peso molecolare presenti in circolo, rispetto al gel di poliacrilammide a concentrazione costante. La cromatografia per esclusione molecolare mi ha permesso di raccogliere separatamente le diverse forme di aggregazione di TTR presenti nel plasma e di verificare l’immunoreattività verso esse del saggio nefelometrico comunemente usato nei laboratorio di analisi per la quantificazione della proteina TTR.
Un ulteriore analisi elettroforetica, associata al saggio nefelometrico, effettuata su campioni di plasma in lito eparina, EDTA o siero, ottenuti da volontari sani, mette in evidenza l’impossibilità di usare il plasma in EDTA rispetto a plasma in lito eparina e siero.

Transthyretin (TTR) is a highly conserved protein synthesized mainly by the liver and the choroid plexus. TTR is a homotetrameric protein (55 Kda) assembled by the interaction of two homodimers (37 kDa). In blood, in physiological conditions, TTR is a protein carrier for the thyroxine (T4) hormone and the retinol binding protein (RBP).
In the last years, the interest for TTR increased a lot since a correlation between TTR and amyloidosis disease has been established. It is possible to distinguish, more in details, two forms of amyloid diseases associated with mutations in the gene for the TTR protein: the Familial Amyloid Polineuropathy (FAP) and the Familial Amyloid Cardiomiopathy (FAC). In addition to the hereditary ones, a form of amyloid disease associated with deposits of wild-type TTR protein (ATTRwt) is also known. The atter occurs mainly in the heart tissue.
TTR amyloidogenic pathway consist of a tetrameric destabilization into a dimeric and monomeric TTR form. Monomers can then aggregate to produce amyloidogenic oligomer forms.
The principal aim of my work was to characterized circulating TTR, for this reason, I set up some biochemicals techniques, such as native electrophoresis, size exclusion chromatography and nephelometry to study native TTR in all its possible forms. For my studies I used plasma samples obtained from healthy subjects and ATTRwt patients.
The electrophoretic method gave me the possibility to study all forms of TTR present in plasma. I chose to perform a polyacrylamide gradient native page (4-20%), instead of using gel with constant polyacrylamide concentration, because it ensured a better resolution for TTR aggregates.
Size exclusion chromatography allowed me to separate and collect the different forms of TTR from plasma. Fractions collected from chromatography were used to investigate the immunoreactivity of the nephelometric test used for TTR quantification. Results suggested that nephelometry only quantify the tetrameric and dimeric TTR forms.
Furthermore, electrophoretic analysis associated with nephelometry quantification of TTR in lithium heparin plasma, EDTA plasma or serum, showed a different behaviour of the protein in the three types of samples. Collected data showed an overrate of TTR quantification in samples containing EDTA in comparison with lithium heparin plasma or serum. Thus plasma EDTA should not be used to quantify this protein.