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Tesi etd-11152017-172806


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
PIZZURRO, FEDERICA
URN
etd-11152017-172806
Title
Generazione di metodiche diagnostiche ed immunizzanti per il virus della Malattia Emorragica Epizootica (EHDV)
Settore scientifico disciplinare
VET/05
Corso di studi
SCIENZE VETERINARIE
Commissione
tutor Dott. Forzan, Mario
correlatore Dott. Lorusso, Alessio
Parole chiave
  • VP7
  • Virus like particles
  • Elisa
  • EHDV
  • Baculovirus
Data inizio appello
02/12/2017;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Riassunto <br>La malattia emorragica epizootica (EHD) è una malattia infettiva virale non contagiosa che colpisce ruminanti selvatici e domestici. La malattia è causata dal virus della malattia emorragica epizootica (EHDV), membro della famiglia Reoviridae, genere Orbivirus. EHDV è considerato essere un arbovirus in quanto viene trasmesso da insetti del genere Culicoides, i quali rappresentano i suoi vettori biologici.<br>Negli ultimi anni sono stati segnalati due sierotipi di EHDV, EHDV-6 e EHDV-7, in diversi paesi del bacino del Mediterraneo, dove hanno causato infezione nei bovini con importanti perdite economiche, soprattutto dovute alla riduzione della produzione di latte. Questo evento, insieme al fatto che il virus viene trasmesso da un vettore già presente nella maggior parte dei paesi Europei, ha sollevato preoccupazioni per una possibile diffusione di EHDV in Europa, che potrebbe seguire quindi lo stesso percorso del virus della Bluetongue (BTV).<br>Sulla base di questa eventualità, la disponibilità di saggi diagnostici e vaccini sicuri rappresenterebbe un aspetto fondamentale per programmi adeguati di sorveglianza e controllo.<br>In questo studio, si segnala lo sviluppo di un saggio ELISA competitivo &#34;Home-made&#34;(cELISA) basato sulla proteina virale ricombinante VP7 (r-VP7) come antigene.<br>La proteina, generata tramite il sistema di espressione del Baculovirus, è stata testata su un totale di 275 campioni di siero compresi i ceppi di riferimento EHDV, campioni di EHDV positivi e negativi precedentemente testati e campioni positivi per BTV e African Horse sickness virus (AHSV).<br>Accuratezza, sensibilità e specificità del saggio sviluppato sono stati rispettivamente 93.1%, 84.1% e 96.9%, indicando che tale saggio può essere quindi utilizzato come valido strumento diagnostico. Il principale vantaggio del test sviluppato è stato l&#39;uso dell’antigene r-VP7 senza complicate fasi di purificazione richiedenti tempo.<br>Al fine di sviluppare un vaccino candidato sicuro sono state generate le EHDV-Virus-Like Particles (VLPs). I geni che codificano le quattro proteine capsidiche principali di un ceppo di campo di EHDV-6 sono stati isolati e clonati per generare due Baculovirus ricombinanti. La corretta espressione dei geni è stata valutata monitorando la sintesi di ciascun mRNA virale in cellule d’insetto infettate e successivamente confermata da Western Blot. Studi di microscopia elettronica hanno confermato la formazione e la purificazione delle VLPs assemblate.<br>I risultati ottenuti in questo studio offrono strumenti diagnostici e di prevenzione interessanti per il futuro per la prevenzione e il controllo del virus della malattia emorragica epizootica, per non essere impreparati in caso di possibili incursioni future.<br><br>Abstract<br>Epizootic haemorrhagic disease (EHD) is an infectious non-contagious viral disease, affecting wild and domestic ruminants. The disease is caused by epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV), which is a member of the Reoviridae family within the Orbivirus genus. EHDV is considered as an arbovirus since it is transmitted by insects of the genus Culicoides, which represent its biological vectors.<br>In recent years two serotypes of EHDV namely EHDV-6 and EHDV-7 have been reported in several countries of the Mediterranean Basin where have caused infection in cattle causing important economic loss, especially due to the reduction of milk production. This event, along with the fact that the virus is transmitted by a vector that is already present on most European countries, has raised concern about a possible EHDV spreading in Europe by following the route of Bluetongue virus (BTV). <br>On this eventuality, the availability of diagnostic assays and safe vaccines would represent a key aspect for adequate surveillance and control programs.<br>In this study, we report the development of a “Home-made” competitive ELISA (cELISA) based on the recombinant viral protein VP7(r-VP7) as antigen. The protein, generated by the baculovirus espression system, was tested on a total of 275 serum samples including EHDV reference strains, previously tested positive and negative EHDV samples, and on BTV and African horse sickness virus (AHSV) positive samples. The accuracy, sensitivity and specificity of the developed assay were 93.1, 84.1 and 96.9%, respectively, indicating that it can used as a valid diagnostic tool. The main advantage of the developed test was the use of rVP7 without complicated and time-consuming purification steps. <br>In order to develop a safe vaccine candidate EHDV-Virus-Like Particles (VLPs) were generated. Genes encoding the four major-capsid proteins of a field strain of EHDV-6, were isolated and cloned to generate two recombinant baculoviruses. The correct expression of genes was evaluated by monitoring the synthesis of each viral mRNA in infected insect cells and subsequently confirmed by Western Blot analysis. Electron microscopy studies confirmed the formation and purification of assembled VLPs.<br>The results obtained in this study offer interesting diagnostic and prevention tools for the prevention and control of EHDV, in order not to be unprepared in the event of his possible future incursion.<br>
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