Thesis etd-11152012-195243 |
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Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
MACEROLA, ELISABETTA
URN
etd-11152012-195243
Thesis title
Analisi dell'espressione di geni codificanti per molecole di adesione e molecole della matrice extracellulare in una serie di carcinomi papillari tiroidei totalmente capsulati e infiltranti il tessuto extratiroideo.
Department
BIOLOGIA
Course of study
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Supervisors
relatore Prof. Basolo, Fulvio
relatore Dott. Giannini, Riccardo
relatore Dott. Giannini, Riccardo
Keywords
- array
- carcinoma papillare tiroideo
- marcatori prognostici
- PCR semiquantitativa
Graduation session start date
06/12/2012
Availability
Withheld
Release date
06/12/2052
Summary
I carcinomi papillari della tiroide (PTC) sono carcinomi ben differenziati che originano dalle cellule follicolari e costituiscono l’80% della totalità dei tumori maligni tiroidei. Questi tumori sono solitamente caratterizzati da una prognosi favorevole, ma in alcuni casi tendono ad assumere un andamento clinico più grave, caratterizzato da recidive locali, metastasi linfonodali e a distanza.
Negli ultimi anni diversi studi hanno cercato di descrivere le basi molecolari di questo comportamento, in particolare andando ad indagare quelle alterazioni la cui correlazione ad una maggiore aggressività del tumore fosse già stata ampiamente documentata (riarrangiamento RET/PTC, mutazioni del gene BRAF ecc.). Ad esempio la mutazione puntiforme V600E del gene BRAF è stata correlata ad un maggior grado di aggressività del tumore, in termini di invasività, di stadio clinico e di rischio di ripresa locale, pertanto, le attuali conoscenze conferiscono al gene BRAF le caratteristiche di buon marcatore di prognosi. In uno studio del 2010 sono stati presi in considerazione quattro diversi gruppi di PTC, tutti simili per dimensioni, ma suddivisi per il loro grado di infiltrazione in: “totalmente capsulati”, “non capsulati infiltranti il parenchima tiroideo”, “infiltranti la capsula tiroidea” ed “infiltranti il tessuto extratiroideo”. Lo studio ha dimostrato che il tasso di mutazione di BRAF è correlato al grado di infiltrazione dei PTC, ed in particolare è stato visto che i PTC “infiltranti la capsula tiroidea” e quelli “infiltranti il tessuto extratiroideo” mostrano una frequenza di mutazione molto simile, mentre la loro classificazione secondo il sistema TNM e di conseguenza il loro trattamento clinico risultano molto diversi. Infatti i casi di PTC infiltranti il tessuto extratiroideo (classificati come T3) sono considerati maggiormente a rischio di recidive locali e metastatizzazione, per cui subiscono trattamenti terapeutici più aggressivi; il fatto che il tasso di mutazione di BRAF nei PTC infiltranti la capsula tiroidea (classificati come T1) non si discosti da quello degli infiltranti il tessuto extratiroideo potrebbe far ipotizzare che questi ultimi siano una potenziale evoluzione dei primi, per cui le alterazioni di BRAF potrebbero dimostrarsi particolarmente utili come marcatori di prognosi. Tuttavia rimangono da chiarire ancora molti aspetti, in quanto non tutti i PTC con comportamento aggressivo presentano le medesime alterazioni molecolari: il proposito di cercare ulteriori possibili alterazioni legate al diverso grado di infiltrazione di questi tumori ha portato a valutare se ci sia una differenza nell’espressione di geni codificanti per molecole di adesione e molecole della matrice extracellulare (ECM) in PTC totalmente capsulati e in PTC infiltranti il tessuto extratiroideo.
La scelta dei campioni è stata estremamente mirata, per cui sono stati selezionati quei casi che presentassero una stretta omologia sia dal punto di vista delle caratteristiche morfologiche, sia per le dimensioni (circa 20 mm di diametro), così che l’unico elemento discriminante fosse la loro capacità infiltrativa.
L’analisi è stata condotta mediante RT-PCR semiquantitativa, con la tecnica della Real Time PCR Arrays, che presenta l’enorme vantaggio di consentire l’analisi simultanea dell’espressione di un pannello di geni in un singolo esperimento: per ogni campione è stata valutata l’espressione di 84 geni codificanti per molecole di adesione e molecole della ECM, a partire da RNA estratto da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina, e poi retrotrascritto in cDNA.
Dai risultati di questa analisi, ottenuti con il metodo del ∆∆Ct in termini espressione differenziale tra 9 PTC totalmente capsulati, utilizzati come termine di raffronto (calibratori), e 9 PTC infiltranti il tessuto extratiroideo, è emerso che numerosi geni del pathway analizzato presentano effettivamente differenze di espressione; tra questi sono stati presi in considerazione alcuni geni su cui condurre ulteriori indagini: Selectina-E, Selectina-L e Vitronectina. In particolare il gene codificante per la Selectina-L è risultato iper-espresso nei PTC infiltranti, mentre i geni codificanti per Selectina-E e Vitronectina sono risultati ipo-espressi negli stessi.
Il passo successivo è quello della validazione dei risultati ottenuti, mediante un duplice approccio: analisi d’espressione con tecniche di RT-PCR semiquantitativa, ampliando il numero di casi presi in esame, pur mantenendo i medesimi criteri di selezione dei campioni, ed analisi immunoistochimiche.
Negli ultimi anni diversi studi hanno cercato di descrivere le basi molecolari di questo comportamento, in particolare andando ad indagare quelle alterazioni la cui correlazione ad una maggiore aggressività del tumore fosse già stata ampiamente documentata (riarrangiamento RET/PTC, mutazioni del gene BRAF ecc.). Ad esempio la mutazione puntiforme V600E del gene BRAF è stata correlata ad un maggior grado di aggressività del tumore, in termini di invasività, di stadio clinico e di rischio di ripresa locale, pertanto, le attuali conoscenze conferiscono al gene BRAF le caratteristiche di buon marcatore di prognosi. In uno studio del 2010 sono stati presi in considerazione quattro diversi gruppi di PTC, tutti simili per dimensioni, ma suddivisi per il loro grado di infiltrazione in: “totalmente capsulati”, “non capsulati infiltranti il parenchima tiroideo”, “infiltranti la capsula tiroidea” ed “infiltranti il tessuto extratiroideo”. Lo studio ha dimostrato che il tasso di mutazione di BRAF è correlato al grado di infiltrazione dei PTC, ed in particolare è stato visto che i PTC “infiltranti la capsula tiroidea” e quelli “infiltranti il tessuto extratiroideo” mostrano una frequenza di mutazione molto simile, mentre la loro classificazione secondo il sistema TNM e di conseguenza il loro trattamento clinico risultano molto diversi. Infatti i casi di PTC infiltranti il tessuto extratiroideo (classificati come T3) sono considerati maggiormente a rischio di recidive locali e metastatizzazione, per cui subiscono trattamenti terapeutici più aggressivi; il fatto che il tasso di mutazione di BRAF nei PTC infiltranti la capsula tiroidea (classificati come T1) non si discosti da quello degli infiltranti il tessuto extratiroideo potrebbe far ipotizzare che questi ultimi siano una potenziale evoluzione dei primi, per cui le alterazioni di BRAF potrebbero dimostrarsi particolarmente utili come marcatori di prognosi. Tuttavia rimangono da chiarire ancora molti aspetti, in quanto non tutti i PTC con comportamento aggressivo presentano le medesime alterazioni molecolari: il proposito di cercare ulteriori possibili alterazioni legate al diverso grado di infiltrazione di questi tumori ha portato a valutare se ci sia una differenza nell’espressione di geni codificanti per molecole di adesione e molecole della matrice extracellulare (ECM) in PTC totalmente capsulati e in PTC infiltranti il tessuto extratiroideo.
La scelta dei campioni è stata estremamente mirata, per cui sono stati selezionati quei casi che presentassero una stretta omologia sia dal punto di vista delle caratteristiche morfologiche, sia per le dimensioni (circa 20 mm di diametro), così che l’unico elemento discriminante fosse la loro capacità infiltrativa.
L’analisi è stata condotta mediante RT-PCR semiquantitativa, con la tecnica della Real Time PCR Arrays, che presenta l’enorme vantaggio di consentire l’analisi simultanea dell’espressione di un pannello di geni in un singolo esperimento: per ogni campione è stata valutata l’espressione di 84 geni codificanti per molecole di adesione e molecole della ECM, a partire da RNA estratto da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina, e poi retrotrascritto in cDNA.
Dai risultati di questa analisi, ottenuti con il metodo del ∆∆Ct in termini espressione differenziale tra 9 PTC totalmente capsulati, utilizzati come termine di raffronto (calibratori), e 9 PTC infiltranti il tessuto extratiroideo, è emerso che numerosi geni del pathway analizzato presentano effettivamente differenze di espressione; tra questi sono stati presi in considerazione alcuni geni su cui condurre ulteriori indagini: Selectina-E, Selectina-L e Vitronectina. In particolare il gene codificante per la Selectina-L è risultato iper-espresso nei PTC infiltranti, mentre i geni codificanti per Selectina-E e Vitronectina sono risultati ipo-espressi negli stessi.
Il passo successivo è quello della validazione dei risultati ottenuti, mediante un duplice approccio: analisi d’espressione con tecniche di RT-PCR semiquantitativa, ampliando il numero di casi presi in esame, pur mantenendo i medesimi criteri di selezione dei campioni, ed analisi immunoistochimiche.
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