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Il presente lavoro si inserisce nel panorama del monitoraggio ambientale, considerato un importante strumento per controllare e tutelare gli ambienti marini. Un biomonitoraggio completo prevede diversi livelli di intervento, il primo dei quali è la misura dei cosiddetti biomarkers, definiti come quelle variazioni biochimiche, cellulari o fisiologiche che possono essere misurate in un organismo, come risposta all’esposizione a composti inquinanti, in quanto il primo effetto di un inquinante si manifesta a livello biochimico/molecolare.
I biomarkers sono sempre più spesso impiegati, ricercando in organismi sentinella direttamente esposti all’ambiente da studiare, risposte identificabili a condizioni di stress, in modo da ottener informazioni sulla qualità dell’ambiente.
Un lavoro di biomonitoraggio fondato sull’impiego delle metallotioneine, come biomarker di esposizione specifico per i metalli pesanti e di organismi bioindicatori, offre la possibilità di rilevare la presenza dei metalli in mare e di mostrare come varia nell’insieme la loro concentrazione nello spazio e nel tempo, a condizione che fattori che potrebbero interferire con la significatività dei risultati, fattori abiotici, ma anche stato ormonale, età, dimensione e sesso degli organismi, siano stati indagati e tenuti in considerazione durante le fasi di campionamento.
Alla base di un simile lavoro deve essere posto un metodo capace di rilevare la concentrazione delle metallotioneine nei tessuti degli organismi scelti come bioindicatori, quindi validare il metodo che si intende applicare, rappresenta il primo passo da intraprendere per eseguire delle analisi attendibili. Sviluppare questo “primo step” è stato l’obbiettivo che si voleva raggiungere svolgendo tale lavoro.
Nel presente studio il metodo impiegato per rilevare la concentrazione delle MT, è stato quello spettrofotometrico, messo a punto nel 1997. Esso prevede il frazionamento con etanolo/cloroformio degli estratti grezzi di organismi marini, per ottenere una frazione di metallotioneina parzialmente purificata, che viene successivamente raccolta per precipitazione. Durante la preparazione del campione sono prese opportune precauzioni per far precipitare tutte le metallotioneine, evitare l’ossidazione dei gruppi sulfidrilici (SH), la contaminazione da tioli solubili a basso peso molecolare e da enzimi di degradazione. Nell’estratto ottenuto dall’omogeneizzazione dei tessuti, la concentrazione delle MT, denaturate in condizioni di basso pH ed elevata forza ionica, viene quantificata spettrofotometricamente utilizzando il reagente di Ellman (DTNB-5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid), che consente di misurare la concentrazione totale delle MT nei materiali biologici, sulla base della quantità di residui sulfidrilici ritrovati. Si sa infatti che le metallotioneine sono caratterizzate da un elevato contenuto di cisterne (20-30% degli aminoacidi totali), a differenza delle altre proteine eventualmente presenti nell’estratto etanolico.
Tra i potenziali organismi bioindicatori, si è scelto di impiegare la triglia Mullus barbatus e il mollusco gasteropode del genere patella, già utilizzati in passato come “organismi sentinella”.
Campioni di patelle (Patella caerulea, Patella rustica, Patella ulyssiponensis) e di triglie (Mullus barbatus) sono stati raccolti lungo la costa toscana del Mar Tirreno, nei mesi di Aprile, Giugno, Agosto ed Ottobre del 2011. Sono stati scelti 7 siti lungo tale costa, in cui effettuare il campionamento delle patelle: la stazione più a nord era quella di Marina di Pisa, seguita andando verso sud dai Bagni Pancaldi a Livorno, scogliera di Calafuria, Castiglioncello, Follonica , Baratti e Castiglione della Pescaia. Le triglie sono state pescate nelle acque di Livorno e Piombino, sempre nei mesi di Aprile, Giugno, Agosto ed Ottobre del 2011.
In aggiunta agli animali, sono stati prelevati campioni di acqua in ciascuna stazione, utilizzati per mettere a punto un sistema di rilevamento della presenza di inquinanti, mediante la determinazione della attività enzimatica di proteine note e sensibili alla inbizione da metalli. Gli enzimi utilizzati sono stati la xantina ossidasi e la fosfatasi alcalina.



La procedura eseguita per confermare il recupero delle metallotioneine, tramite il protocollo applicato ai tessuti delle patelle, ha permesso di validarne l’impiego per l’estrazione di tali proteine.
Nonostante il recupero sia stato del 35% circa, a causa probabilmente del deperimento della metallotioneina acquistata, conservata per un mese in soluzione, o dell’eventuale ossidazione dei gruppi sulfidrilici, in seguito a reazione con qualche sostanza presente nell'estratto grezzo, è evidente un incremento lineare di assorbanza in funzione della concentrazione delle metallotioneine aggiunte, sufficiente a confermare la validità del protocollo.
I dati ricavati sulla concentrazione delle MT, sono stati sottoposti ad analisi statistica, analisi della varianza a due vie di classificazione: le variabili considerate, periodo e stazione, influivano in maniera significativa sulla concentrazione, sia per le patelle, che per le triglie.
L’andamento della concentrazione delle metallotioneine, mostrato dai risultati ottenuti, ha evidenziato concentrazioni più elevate negli organismi campionati nei siti situati più a sud della costa Toscana.
Tramite il saggio di inibizione enzimatica, applicato ai campioni di acqua, è stata osservata un’ inibizione considerevole dell’enzima xantina ossidasi, durante il mese di Aprile, in tutte le stazioni, con valori più elevati nei siti sud del tratto di costa indagato.