• gamma-glutamiltransferasi
• nitrosoglutatione

Riassunto

Il nitrosoglutatione (GSNO) è una molecola biologica che deriva dal legame tra il monossido di azoto (NO) e una molecola di glutatione (GSH). L’NO viene prodotto a partire dalla L-arginina grazie all’azione di enzimi appartenenti alla famiglia delle NO-sintetasi (NOS), ed è coinvolto nella modulazione di importanti processi quali la regolazione del tono vascolare, la trasmissione nervosa ed il processo flogistico. Vista l'elevata reattività dell'NO - la cui emivita in vivo è di pochi secondi - è stato ipotizzato che esso possa espletare la sua azione anche in distretti lontani rispetto al sito di sintesi grazie alla formazione di derivati più stabili con molecole come i tioli a basso peso molecolare, tra cui il GSH.
Il GSH è il substrato principale della gamma-glutamiltransferasi (GGT), l’unico enzima in grado di idrolizzare il legame gamma-glutamilico presente tra gli amminoacidi glutammato e cisteina all’interno della molecola del glutatione e dei suoi derivati. Nel caso del GSNO l’azione della GGT porta alla formazione di un prodotto meno stabile – la S-nitroso-cisteinil-glicina – che, decomponendosi, cede NO e ne consente l’interazione con altre molecole nelle immediate vicinanze.
In particolare, NO è in grado di determinare reazioni di S-nitrosilazione di proteine target tra le quali alcuni importanti fattori coinvolti nelle modulazione della trasduzione del segnale. In questa prospettiva, numerosi studi hanno focalizzato l’attenzione sul possibile effetto del GSNO e di altri donatori di ossido nitrico nella modulazione del processo flogistico, con particolare riguardo all’espressione di citochine infiammatorie come IL-8 e TNFα. L’impiego di terapie a base di GSNO aerosol è stato inoltre valutato in pazienti affetti da fibrosi cistica – una patologia in cui i livelli polmonari di GSNO sono più bassi rispetto alle condizioni fisiologiche – ma con risultati non ancora definitivi. Parallelamente altri Autori hanno descritto un aumento significativo dei livelli di GGT nel lavaggio broncoalveolare di pazienti affetti da fibrosi cistica con concomitante processo flogistico, mentre nessuna differenza è stata osservata tra pazienti affetti da tale patologia, ma senza processo flogistico in atto, e soggetti sani di controllo.
Sulla base di queste considerazioni, lo scopo della presente Tesi è stato quello di valutare il possibile ruolo del GSNO – in presenza o meno di GGT – nella sintesi e nel rilascio dell’IL-8, in una linea di cellule epiteliali bronchiali (IB3-1) derivate da un paziente affetto da fibrosi cistica con mutazione ΔF508.
I dati raccolti hanno permesso di confermare una produzione basale di IL-8 più elevata nella linea IB3-1 rispetto alla linea isogenica di controllo C38. Allo scopo di studiare gli effetti di GSNO e GGT sulla produzione di IL-8, sono state messe a punto delle condizioni sperimentali idonee - sia in termini di concentrazioni degli analiti utilizzati che di tempi di esposizione - facendo riferimento ai dati presenti in letteratura al riguardo. In queste condizioni, trattamenti indipendenti con GSNO e GGT non determinano variazioni dei livelli di espressione di IL-8 nella linea IB3-1, mentre la contemporanea esposizione ad entrambi gli agenti ne riduce in maniera significativa la produzione. Analogamente, l’incremento di produzione di IL-8 indotto nella linea IB3-1, in seguito ad esposizione a lipopolisaccaride (LPS) – un costituente della parete esterna dei batteri Gram negativi – viene significativamente ridotto dal co-trattamento con GSNO e GGT. L‘insieme di questi dati suggerisce dunque che gli effetti osservati sono da imputarsi proprio all’NO rilasciato dal GSNO in presenza di GGT.
I meccanismi implicati negli effetti osservati sono stati quindi studiati prendendo in esame il possibile ruolo dei principali pathways di trasduzione del segnale noti per il loro coinvolgimento nell’espressione di IL-8, ovvero, la via di segnalazione di NF-kB (nuclear-factor kB) e quella delle MAP chinasi (mitogen-activated protein).
NF-kB è un eterodimero costituito dalle subunità p50 e p65 e, nello stato inattivo, è normalmente localizzato nel citoplasma complessato ad un inibitore, IkB. Vari stimoli – tra cui LPS – portano alla fosforilazione e alla successiva degradazione di IkB, cosa che permette a NF-kB di traslocare nel nucleo e di interagire con specifiche sequenze consenso poste nel promotore di diversi geni che codificano per effettori del processo flogistico, tra cui IL-8. L’analisi del legame al DNA di NF-kB mediante saggio EMSA ha permesso di osservare un effetto inibitorio dell’NO sul legame al DNA indotto dal trattamento con LPS, anche se lo studio dei livelli di traslocazione nucleare di NF-kB mediante western blot dei nuclei isolati non mostra differenze significative tra i vari trattamenti. I dati ottenuti sembrano dunque indicare un diretto coinvolgimento della via di segnalazione di NF-kB negli effetti osservati, con un’azione mirata dell’NO non tanto ad impedire l’attivazione di NF-kB quanto il suo legame al DNA. In questo senso, alcuni Autori hanno suggerito che NO – tra i vari modi proposti – potrebbe modulare l’attività di NF-kB attraverso la nitrosilazione di alcune tirosine presenti nella subunità p50, cosa che non ne impedirebbe la traslocazione nel nucleo ma ne inibirebbe il legame al DNA.
Per quanto riguarda la modulazione delle MAP chinasi, l’analisi mediante western blot ha messo in evidenza l’induzione da parte di NO della fosforilazione di p38 e la concomitante inibizione della fosforilazione di ERK 1/2. Nel primo caso NO induce un’attivazione della via di p38, mentre nel secondo determina un’inibizione della via di ERK1/2. Nessun effetto è stato osservato per quanto riguarda lo stato di attivazione di JNK. Gli esiti di queste modulazioni sarebbero antitetici: l’attivazione di p38 è stata infatti correlata con una stabilizzazione dell’mRNA di IL-8 e, quindi, con un incremento della sua espressione. Al contrario, l’inibizione di ERK1/2 determinerebbe – come per NF-kB – una riduzione dell’espressione del gene di IL-8.
Sulla base dei risultati ottenuti sembra comunque evidente che, nel complesso, gli effetti inibitori dell’NO prevalgano su quelli induttivi, probabilmente proprio grazie all’inibizione del pathway di NF-kB, la cui funzione fondamentale nell’espressione di IL-8 è stata ripetutamente dimostrata.
In conclusione, quindi, il rapido catabolismo del GSNO da parte della GGT sembra poter condizionare in maniera significativa l’espressione di IL-8, esercitando un’azione potenzialmente antiinfiammatoria. In questa prospettiva l’efficacia dell’impiego del GSNO aerosol a scopo terapeutico potrebbe essere fortemente condizionata dai livelli di GGT espressi a livello polmonare, come nel caso dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Ulteriori studi saranno necessari per chiarire completamente il reale impatto di tali trattamenti in vivo.