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• silencing
• nucleotidase
• nucleotidasi
• pifitrina-α
• silenziamento

La 5’-nucleotidasi citosolica di tipo II (cN-II) è un enzima altamente conservato, ubiquitario, appartenente alla famiglia delle 5’-nucleotidasi, composta da sette isoforme classificate in base a localizzazione (cinque citosoliche, una mitocondriale, un ectoenzima transmembrana), regolazione e specificità di substrato. La cN-II è specifica per i nucleosidi 6-ossipurinici 5’- monofosfato (IMP, dIMP, GMP, dGMP, XMP) con una preferenza per l’IMP (KmIMP = 100 µM) rispetto al GMP (KmGMP = 600 µM). La cN-II è un enzima bifunzionale, la sua catalisi passa attraverso la formazione di un intermedio covalente enzima-fosfato con la liberazione del nucleoside, a questo punto l’intermedio può subire l’attacco nucleofilo da parte di una molecola d’acqua e generare fosfato inorganico (attività fosfoidrolasica) o da parte di un ristretto numero di nucleosidi accettori generando il nucleoside monofosfato corrispondente (attività fosfotransferasica).
Il meccanismo d’azione la colloca nella superfamiglia delle aloacido dealogenasi (HAD), e la sua regolazione è di tipo allosterico, con almeno tre conformazioni, stabilizzate da diversi composti: una conformazione ad elevata attività, stabilizzata da diversi composti fosforilati quali ATP, ADP, BGP (2,3-bisfosfoglicerato), Ap4A (diadenosina tetrafosfato) e più in generale da una alta carica energetica cellulare; una conformazione a bassa attività, stabilizzata dal fosfato inorganico; una conformazione inattiva, indotta da stress ossidativo.
L’azione della cN-II si inserisce nel metabolismo delle purine, e più in generale nelle vie di recupero, ma non solo. Diversi autori la indicano come responsabile, direttamente o meno, della farmaco-resistenza agli antitumorali in cellule ad elevata proliferazione, le quali spesso presentano iperespressione di cN-II. La resistenza si manifesta anche quando gli analoghi di nucleotidi e nucleosidi utilizzati come farmaci non sono substrati diretti dell’enzima.
Questo lavoro di tesi è un tassello di un mosaico più ampio: un progetto volto a valutare gli effetti del silenziamento indotto della 5’- nucleotidasi citosolica di tipo II in un modello di cellule mucoepidermoidi di carcinoma polmonare umano (NCI-H292), e consecutivamente validare i risultati ottenuti in un secondo modello cellulare di carcinoma polmonare umano (A549).
Il silenziamento viene indotto mediante trasfezione di un plasmide recante uno shRNA target di cN-II (pScN-II), che determina un decremento dell’attività dell’enzima di circa il 50%. Il corrispettivo controllo viene trasfettato con un plasmide identico che non reca lo shRNA (pScont).
Il silenziamento dell’enzima viene effettuato in maniera analoga in entrambi i modelli cellulari.
Dai dati preliminari ottenuti sulle A549, sulle NCIH292 e su cellule di astrocitoma umano le ADF, i modelli cellulari silenziati risultano caratterizzati da una minore proliferazione cellulare, un metabolismo più ossidativo, un maggiore potenziale antiossidante, inibizione di Akt e attivazione di AMPK, e soprattutto una maggiore stabilizzazione di p53 e del suo principale target p21.
Nel tentativo di identificare se la P53 fosse direttamente responsabile di tali cambiamenti, sia le silenziate che le controllo di ciascuno dei due modelli cellulari sono stati trattati con l’inibitore di p53, Pifitrina-a, nel tentativo di valutare se il trattamento con l’inibitore annullasse gli effetti del silenziamento in entrambi i modelli cellulari. Per ciascun modello, sono state valutate quattro condizioni: pScont con e senza inibitore di p53, pScN-II con e senza inibitore di p53.
Il mio lavoro di tesi va a implementare con altri esperimenti il lavoro sulle NCIH292 silenziate e di controllo e contemporaneamente a ricercare se anche in un’altra linea cellulare, le A549 silenziate e di controllo, la pifitrina riuscisse a riportare le cellule silenziate ai valori del controllo dimostrando anche in questo modello un coinvolgimento della P53.
Per quanto riguarda le NCI-H292, ho misurato la curva di crescita, la concentrazione di lattato extracellulare prodotto durante la crescita, la quantità di SIRT1, deacetilasi NAD+- dipendente nucleare, sensore dei nutrienti e regolatore del metabolismo, che ha tra i suoi target p53 acetilato.
Si è valutato inoltre un eventuale destino autofagico trattando le cellule con gli inibitori dell’autofagia E64D e PEPSTATINA A.
In seguito, si è passati all’inibizione di p53 nel secondo modello cellulare di carcinoma polmonare umano, A549 mediante Pifitrina-a.
Sono state esaminate innanzitutto la curva di crescita e l’attività fosfotransferasica dell’enzima, il lattato extracellulare, AMPK e AMPK-P, sensori del calo energetico, Akt e Akt-P, indici della proliferazione cellulare, i livelli di p53 e p53-P, e del suo target p21.
Dai risultati ottenuti nelle NCI-H292 per quanto riguarda la proliferazione non si riscontrano significative differenze tra trattati e controlli, mentre i livelli di SIRT1-P si riducono sia nelle cellule silenziate che nei controlli entrambi trattati con pifitrina, per laSIRT-1 totale, invece, non si osservano modifiche nell’ espressione della proteina. La concentrazione di lattato extracellulare risulta più bassa nelle cellule silenziate e ritorna ai valori del controllo in presenza dell’inibitore. Si osserva inoltre, un aumento del flusso autofagico nelle cellule silenziate.
Dai risultati ottenuti dai lavori preliminari svolti sulle A549 in assenza e presenza di pifitrina, non si riscontrano differenze significative né nella proliferazione, né nei vari marcatori saggiati.
Alla luce dei dati raccolti, il duplice comportamento nei modelli cellulari trattati o meno con Pifitrina-a, indicherebbero un effetto multiplo dell’inibitore, già noto in letteratura, il quale non agirebbe in maniera specifica solo su p53. A determinate condizioni, ancora da valutare, la Pifitrina-a potrebbe agire sia a valle di p53, dato l’aumento del flusso autofagico, sia a monte, come indicato dai dati raccolti su SIRT1.
In conclusione, il pathway di p53 resta uno dei candidati, per spiegare l’attenuazione del fenotipo tumorale indotta dal silenziamento della 5’- nucleotidasi citosolica di tipo II, ma non sempre sembra essere coinvolto in maniera diretta.