• checkpoint del fuso mitotico
• coesina
• separasi

Il mantenimento della stabilità del genoma è garantito dai meccanismi di riparazione del DNA, da una corretta segregazione dei cromatidi fratelli e dalla presenza di punti di controllo (checkpoints) a vari livelli del ciclo cellulare. In particolare, uno degli eventi più critici del ciclo cellulare è la separazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule figlie che si realizza alla transizione metafase-anafase. Questo processo è sotto il controllo dello Spindle Assembly Checkpoint (SAC), o checkpoint del fuso mitotico, che controlla le interazioni tra i cromosomi e le fibre del fuso mitotico: solo quando i cinetocori di tutti i cromosomi sono correttamente attaccati alle fibre del fuso, la cellula entra in anafase. Numerose proteine contribuiscono all’azione del checkpoint tra cui MAD1, MAD2, BUBR1, BUB1 e BUB3. Queste proteine regolano la capacità di Cdc20 di attivare l’ Anaphase Promoting Complex (APC/C), un complesso con attività ubiquitina ligasi che è responsabile della ubiquitinazione di alcune proteine chiave del ciclo cellulare tra cui la ciclina B e la securina. Fino al momento della transizione metafase-anafase, l’unione dei cromatidi fratelli è garantita dalla coesina, un complesso proteico costituito da quattro subunità: due proteine appartenenti alla famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosome), SMC1A e SMC3, e due proteine non SMC, RAD21 e SA. All’inizio dell’anafase la coesina viene rimossa in due steps successivi: nel primo, viene rimossa la coesina a livello dei bracci cromosomici in seguito alla fosforilazione di RAD21 e di SA da parte della Polo-like chinasi 1; nel secondo, viene rimossa la coesina centromerica per intervento della proteina Separasi che effettua un taglio a livello della subunità RAD21. Prima dell’anafase, la Separasi è inattiva nel complesso Securina-Separasi. Tale complesso unisce il pathway del SAC con quello della coesina. Infatti, alla transizione metafase-anafase, il corretto legame dei centromeri ai microtubuli dal fuso innesca un segnale che porta alla ubiquitinazione della Securina, operata dall’APC, ciò determina l’attivazione della Separasi la quale può rimuovere la coesina centromerica consentendo la separazione dei cromatidi fratelli.
Il gene separasi è localizzato sul cromosoma 12q13 e codifica per una endopeptidasi appartenente al gruppo di cisteina-proteasi. Evidenze sperimentali suggeriscono che la Separasi possa comportarsi come un oncogene. Infatti la sua over-espressione è stata trovata nel tumore della prostata e della mammella. Ad oggi, invece, poco è noto circa gli effetti di una sua down-regolazione. Lo scopo di questa tesi è stato quello di investigare gli effetti della inibizione della Separasi in cellule umane.
L’inibizione della espressione della Separasi è stata eseguita tramite la tecnica dell’RNA interference (iRNA) in colture cellulari di fibroblasti umani primari. Attraverso esperimenti di Western Blot abbiamo dapprima confermato la down-regolazione della Separasi. Successivamente sono stati allestiti i vetrini per l’analisi delle piastre metafasiche. Tale analisi ha evidenziato la presenza di una elevata frequenza di cellule aneuploidi, come ci si potrebbe attendere sulla base del suo ruolo. Tuttavia, del tutto inatteso, è stata la presenza di aberrazioni cromosomiche strutturali, come gaps e rotture. Dati ottenuti in Drosophila, attraverso una collaborazione con un gruppo di ricerca dell’Università dell’Aquila, indicano che ceppi mutanti per la Separasi mostrano lo stesso fenotipo, ossia aneuploidia ed aberrazioni cromosomiche. Inoltre, tali ceppi mutanti mostrano un aumento di RAD50, una proteina del complesso NMR coinvolto nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA, suggerendo che la Separasi possa regolare RAD50. Al momento, tuttavia, attraverso tecniche di co-immunoprecipitazione non siamo riusciti a dimostrare una interazione diretta tra la Separasi e RAD50. Nel complesso questi dati suggeriscono che la Separasi, oltre a controllare la corretta segregazione dei cromatidi fratelli, gioca un ruolo anche nel mantenimento dell’integrità strutturale dei cromosomi anche se rimane ancora da chiarire attraverso quali meccanismi esplica questo ruolo.