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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-11112013-094005


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
NOCENTE, MARIA GRAZIA
URN
etd-11112013-094005
Titolo
POLIPOSI INTESTINALE AUTOSOMICA RECESSIVA: DEFINIZIONE DEL RUOLO DELLE VARIANTI DI SEQUENZA DEL GENE MUTYH
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Relatori
relatore Prof. Genuardi, Maurizio
correlatore Prof. Landi, Stefano
correlatore Dott.ssa Caligo, Maria Adelaide
relatore Prof. Paolicchi, Aldo
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
09/12/2013
Consultabilità
Completa
Riassunto
Il carcinoma colorettale (CCR) è il secondo tumore più frequente in Europa. La presenza di familiarità in una frazione consistente (30%) dei casi suggerisce il coinvolgimento di fattori genetici. Mutazioni ereditarie altamente penetranti associate a quadri clinici ben caratterizzati sono state identificate nel 5% dei casi di CCR. Oggi si conoscono diverse forme cliniche e diversi geni responsabili di predisposizione ereditaria allo sviluppo di CCR. Le condizioni più frequenti sono la Sindrome di Lynch (SL), associata a mutazioni a carico di geni coinvolti nel sistema del Mismatch Repair, la poliposi adenomatosa familiare (Familial Adenomatous Polyposis, FAP) associata a mutazioni dell’oncosoppressore APC, e la poliposi associata al gene MUTYH (MUTYH-Associated Polyposis (MAP), dovuta a mutazioni del gene MUTYH. A differenza delle altre forme, tutte trasmesse con modalità autosomica dominante, la MAP è un carattere autosomico recessivo, ed è dovuta a difetti del sistema di riparo dei danni ossidativi al DNA per escissione di basi (Base Excision Repair, BER). In particolare, il gene responsabile di questa forma di poliposi è MUTYH, che codifica una glicosilasi che rimuove l’adenina dall’appaiamento anomalo A:8-OxoG (7,8-diidro-8-oxo-guanina). La caratterizzazione molecolare dei tumori (polipi e carcinomi) dei soggetti con difetti costituzionali di MUTYH ha evidenziato un eccesso di trasversioni somatiche G>T nei geni coinvolti nella tumorigenesi colorettale, in particolare APC e KRAS. Attualmente il Leiden Open Variation Database riporta poco più di 100 differenti varianti di sequenza di MUTYH. Accanto a varianti di chiaro significato patogenetico, esistono varianti più rare, disperse su tutto il gene e di difficile interpretazione. Dall’analisi dei dati presenti in letteratura è emerso che circa il 30% delle varianti nucleotidiche riscontrate in MUTYH è costituito da Variant of Unknown Significance (VUS). La maggior parte delle VUS sono variazioni di sequenza di tipo missenso, che possono determinare alterazioni della struttura e/o della funzione della proteina codificata o, in alternativa, possono avere effetti a livello dell’mRNA. Possono altresì presentarsi varianti silenti o alterazioni nella sequenza nucleotidica, nelle regioni regolatrici e non codificanti dei geni (introni, 5’UTR e 3’UTR). L’identificazione delle mutazioni che alterano la funzionalità di una proteina e sono responsabili della comparsa di fenotipi patologici è di grande importanza per la diagnosi e il counseling genetico. Infatti, in presenza di una VUS non è possibile effettuare test predittivi, e ciò lascia incertezza sull’entità del rischio per i membri della famiglia. Negli ultimi anni, sono stati utilizzati molteplici approcci indipendenti al fine di chiarire il ruolo clinico e biologico delle VUS. Tali approcci, suddivisi in diretti ed indiretti, sono basati su analisi di segregazione, studi caso-controllo, predizioni in silico, analisi di splicing ed espressione genica, e saggi funzionali in vitro.
Scopo del lavoro di questa tesi è stato quello di valutare il significato e la frequenza di 7 VUS del gene MUTYH identificate nella nostra casistica di pazienti con sospetta MAP mediante l’utilizzo di approcci molecolari e bioinformatici. A tal fine sono stati effettuati: 1. studio di DNA di campioni di controllo mediante High Resolution Melting Analysis (HRMA) e sequenziamento diretto; 2. studio del tessuto tumorale dei soggetti in cui segregano le VUS mediante sequenziamento diretto al fine di identificare la presenza di Loss of Heterozigosity (LOH); 3. predizioni in silico delle potenziali conseguenze delle VUS sulla funzione dei prodotti proteici e sullo splicing, grazie all’utilizzo di programmi dedicati. In base a tale analisi è stato possibile classificare le VUS in base alle indicazioni dello IARC Working Group on Unclassified Genetic Variants (Plon et al., Hum. Mutat. 2008, 29:1282-1291). I dati ottenuti dimostrano l’importanza di un approccio multidisciplinare al fine di una corretta classificazione delle VUS.
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