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I cambiamenti degenerativi dell’endometrio sono tra le cause principali di riduzione della fertilità nelle fattrici e tra i problemi più comuni in ippiatria. Nella fattrice sana l’utero risulta protetto dalla contaminazione esterna grazie alla presenza di barriere anatomiche quali vulva, vestibolo, vagina e cervice, la cui compromissione è tra le cause principali di infiammazione uterina cronica.
Alla luce di studi recenti che ipotizzano che la modulazione della risposta immunitaria locale abbia un ruolo nello sviluppo della fibrosi endometriale e nella condizione degenerativa di endometrite, lo scopo di questa tesi è quindi lo studio dell'espressione di tre geni (DEFB4B, LYZ e SLPI) le cui variazioni a livello uterino (in dipendenza dall’età della cavalla) risultano coinvolte nella risposta infiammatoria cronica caratterizzante l’endometrite persistente. La conferma di una possibile associazione tra la variazione dell’espressione di questi geni e la condizione patologica dell’endometrite persistente li renderebbe dei possibili marcatori diagnostici per la suscettibilità a tale condizione patologica.
Nello studio abbiamo coinvolto 19 fattrici diverse per età (“giovani” e “anziane”) e per quadro clinico (le “anziane” con anamnesi di degenerazione endometriale cronica effettuata tramite il sistema di categorizzazione istopatologica secondo la scala Kenney – Doig) con lo scopo di valutare l’espressione dei geni in studio a livello uterino, attendendoci un’espressione atipica nelle cavalle più anziane.
Il protocollo sperimentale ha previsto l’iniziale estrazione di RNA totale da tessuto (campione di biopsia uterina) con controllo della resa dell’estrazione sia a livello qualitativo (elettroforesi su gel agarosio all’1%) che quantitativo (spettrofotometria).
Si è proceduto con la retrotrascrizione per ottenere cDNA da utilizzare nelle fasi successive in cui si è effettuata la PCR quantitativa (qPCR) ottimizzando i parametri per ogni gene in studio (temperatura di annealing e numero di cicli da effettuare). Oltre ai tre geni studiati p stato sempre amplificato anche un gene housekeeping (GAPDH), per la normalizzazione dei dati, con adeguati controlli negativi.
I dati sono stati analizzati tramite quantificazione relativa (metodo di Pfaffl) valutando i ratio ottenuti nei due gruppi in studio e sottoponendoli ad analisi statistica.
I risultati ottenuti hanno evidenziato una differenza significativa di espressione dei geni LYZ e DEFB4B che risultano up-regolati nelle cavalle di età più avanzata e con diagnosi di endometrite cronica, rispetto alle fattrici giovani (sane); potremmo presupporre che le fattrici più giovani esprimano DEFB4B e LYZ a livello uterino a livelli più bassi come indicativo di una più equilibrata immunomodulazione locale, con conseguente riduzione delle vie infiammatorie e una più lenta progressione verso la deposizione di tessuto fibrotico rispetto alle cavalle più anziane in cui si verifica la perdita del pieno controllo sulla regolazione del sistema Immunitario predisponendo l’organismo all’instaurarsi di una condizione infiammatoria cronica. Ulteriori studi circa la relazione tra l’up-regolazione di questi geni, il grado di endometrite e l’età della cavalla sarebbero necessari a conferma di tale ipotesi.



Degenerative changes in the endometrium are one of the main causes of reduced fertility in mares and among the most common problems in hippiatria. In healthy mares, uterus is protected from external contamination thanks to the presence of anatomical barriers such as vulva, vestibule, vagina and cervix, whose impairment is one of the main causes of chronic uterine inflammation.
In light of recent studies that speculate that the modulation of the local immune response plays a role in the development of endometrial fibrosis and in the degenerative condition of endometritis, the aim of this thesis is the study of the expression of three genes (DEFB4B, LYZ and SLPI ) whose variations at the uterine level (depending on the age of the mare) are involved in the chronic inflammatory response characterizing persistent endometritis. Confirmation of a possible association between the variation in the expression of these genes and the pathological condition of persistent endometritis would make them possible diagnostic markers for susceptibility to this pathological condition.
We involved 19 mares of different ages ("young" and “old”) and clinical conditions (the elderly with a history of chronic endometrial degeneration carried out through the histopathological categorization system according to the Kenney - Doig scale) with the aim to evaluate the expression of the genes at the uterine level, expecting an atypical expression in older mares.
The experimental protocol provided for the initial extraction of total RNA from tissue (uterine biopsy sample) with control of the extraction yield both qualitatively (electrophoresis on 1% agarose gel) and quantitative (spectrophotometry).
We proceeded with the reverse transcription to obtain cDNA to be used in the subsequent phases in which the quantitative PCR (qPCR) was performed by optimizing the parameters for each gene under study (annealing temperature and number of cycles). In addition to the three genes studied, a housekeeping gene (GAPDH) was always amplified, for data normalization, with adequate negative controls.
The data were analyzed by relative quantification (Pfaffl method) by evaluating ratios obtained in the two study groups and subjecting them to statistical analysis.
The results obtained showed a significant difference in the expression of LYZ and DEFB4B that are up-regulated in older mares diagnosed with chronic endometritis, compared to young (healthy) mares; we might assume that younger mares express DEFB4B and LYZ at lower levels as indicative of a more balanced local immunomodulation, resulting in reduced inflammatory pathways and slower progression towards fibrotic tissue deposition than older mares in which occurs in the loss of full control over the regulation of the immune system, predisposing the body to chronic inflammatory condition. Further studies on the relationship between the upregulation of these genes, the degree of endometritis and the age of the mare would be needed to confirm this hypothesis.