• 5'-nucleotidasi citosolica II
• contenuto nucleotidico
• elettroforesi capillare

La 5’-nucleotidasi citosolica II (cN-II) è un enzima ubiquitario e molto conservato appartenente alla famiglia delle 5’-nucleotidasi (5’-NT). Le 5’-NT costituiscono un ampio gruppo di fosfoesterasi che catalizzano l’idrolisi dei nucleosidi 5’-monofosfato nei corrispondenti nucleosidi più fosfato inorganico e che differiscono per localizzazione cellulare, specificità di substrato, regolazione e sequenza amminoacidica. Questi enzimi, essendo coinvolti nel metabolismo nucleotidico, hanno un ruolo importante nella regolazione dei pools ribo- e deossi-ribonucleotidici, pools che a loro volta giocano un ruolo cruciale nel bilancio energetico cellulare, nella regolazione metabolica e nella divisione cellulare. I substrati preferenziali dell’enzima cN-II sono i nucleosidi 6-idrossipurinici 5’-monofosfato (IMP e GMP) e i loro deossiderivati (dIMP e dGMP), dai quali rimuove il gruppo fosfato esterificato al carbonio 5’. Una delle caratteristiche peculiari dell’enzima è la sua bifunzionalità: infatti, ha sia un’attività fosfatasica, con la quale catalizza il trasferimento del gruppo fosfato ad una molecola di acqua, che un’attività fosfotransferasica con la quale può cedere tale gruppo ad un nucleoside accettore. In entrambi i casi, la reazione procede attraverso la formazione di un intermedio covalente enzima-fosfato. Nel caso dell’attività fosfotransferasica solo un ristretto numero di nucleosidi funge da accettore: inosina, guanosina, deossiinosina e alcuni composti (analoghi di nucleosidi) usati come profarmaci antitumorali e antivirali. La cN-II perciò, oltre ad avere un ruolo attivo nella regolazione del pool purinico intracellulare, sembra essere coinvolta nella resistenza ad alcuni farmaci antitumorali analoghi delle purine. Il suo coinvolgimento nella risposta al trattamento tumorale è stato documentato in pazienti adulti affetti da leucemia mieloide. In questi soggetti, gli alti livelli di trascrizione dell’enzima sono stati associati a un peggioramento del successo terapeutico. La cN-II è un enzima tetramerico, Mg2+ dipendente ed allostericamente attivato da ATP, ADP, 2,3-bisfosfoglicerato (BPG), diadenosinatetrafosfato (Ap4A) ed alte concentrazioni di KCl, mentre è inibito dal fosfato inorganico. Un’alta attività enzimatica è stata riscontrata in tessuti e cellule con un elevato turnover degli acidi nucleici e dei loro precursori: milza, testicoli, fibroblasti e cellule endoteliali. Il cervello, il cuore, i muscoli scheletrici e gli eritrociti presentano invece un’attività enzimatica molto ridotta. Data la maggiore attività in cellule in attiva proliferazione e l’importanza della carica energetica nella regolazione dell’enzima, si pensa che uno dei suoi ruoli sia quello di idrolizzare gli eccessi di IMP derivanti dalla sintesi de novo o dalla via di recupero delle purine in condizioni di carica energetica alta. In condizioni di ischemia, nella quale si assiste ad una deplezione di ATP, l’attività dell’ enzima diminuisce notevolmente prevenendo la perdita dei composti purinici. È ampiamente documentata un’alta attività enzimatica della cN-II in svariate linee cellulari tumorali caratterizzate da una grande attività proliferativa. Queste osservazioni denotano il rilevante ruolo che gli inibitori della cN-II potrebbero giocare nella terapia antitumorale. Al fine di capire le conseguenze molecolari e biochimiche dell’inibizione dell’enzima sono state messe a punto linee cellulari tumorali nelle quali è stato operato il silenziamento dell’enzima. Il gruppo di ricerca con cui lavoro, dopo aver valutato diversi parametri metabolici e funzionali in un modello cellulare di carcinoma polmonare umano con un parziale silenziamento della cN-II, ha rilevato una variazione di alcuni parametri (diminuzione della crescita cellulare, shift metabolico da un fenotipo glicolitico ad uno più ossidativo, diminuzione della sintesi proteica, diminuzione della motilità cellulare, attivazione dell’autofagia, sbilanciamento del pool nucleotidico), che conferiscono l’aggressività al fenotipo tumorale. Questi cambiamenti metabolici e funzionali si osservano in concomitanza all’aumento di p53 fosforilata. Si è ipotizzato che lo sbilanciamento dei composti purinici e pirimidinici possa essere la causa di un blando stress che determina l’attivazione di p53, dalla cui attivazione potrebbero dipendere le modifiche osservate nelle cellule silenziate. A fronte di questi risultati il mio lavoro di tesi, inserito in un progetto più ampio, ha lo scopo di valutare le eventuali differenze nel pool nucleotidico tra due linee cellulari silenziate e i loro controlli. A questo scopo ho usato due linee cellulari: una di adenocarcinoma polmonare umano (NCI-H292) ed una di adenocarcinoma mammario umano (MDA-MB-231). In entrambe le linee, l’inibizione dell’enzima è stata ottenuta sia tramite la tecnica del silenziamento sia tramite la tecnica CRISPR/Cas9, procedimenti che determinano gradi diversi di silenziamento. Entrambe le linee cellulari presentano quindi la versione altamente silenziata (circa 10% di attività residua con tecnica CRISP) e quella costitutivamente silenziata (circa il 50% di attività residua) ciascuna con il proprio controllo. Le analisi delle concentrazioni nucleotidiche negli estratti cellulari sono state effettuate tramite l’HPCE, High-Performance Capillary Electrophoresis. Negli ultimi anni la quantificazione dei nucleotidi tramite elettroforesi capillare si è rivelata essere un metodo più accurato, riproducibile e sensibile rispetto alla cromatografia su colonna HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). L’applicazione di un modello di estrazione rispettoso della struttura nucleotidica e la modifica di un protocollo di separazione presente in letteratura ci ha permesso di separare in modo ottimale varie specie nucleotidiche presenti a livello cellulare: nucleosidi trifosfato (UTP, CTP, GTP, ATP), nucleosidi difosfato (UDP, UDPG, CDP, GDP, ADP), nucleosidi monofosfato (UMP, GMP, AMP, IMP), e nucleosidi nicotinamidici (NADP e NAD).