• stress ossidativo
• sclerosi laterale amiotrofica
• NRF2

Lo stress ossidativo è uno dei meccanismi patogenetici della SLA. Diverse sono le evidenze sperimentali che sostengono questa ipotesi, tra queste possiamo trovare: gli aumentati livelli dei biomarcatori di stress ossidativo nei pazienti con SLA sporadica, le alterazioni delle proteine mitocondriali nei motoneuroni dei pazienti con SLA, e la presenza nei pazienti affetti da SLA di una compromissione di diversi meccanismi di difesa contro gli agenti ossidanti, tra cui il pathway Nrf2-ARE, da cui dipende l’attivazione dei principali meccanismi antiossidanti. La proteina Nrf2, presente in condizioni normali nel citosol, viene inattivata attraverso il legame con la proteina Keap1; in caso di aumento dello stress ossidativo Nrf2 si dissocia da Keap1 e trasloca nel nucleo dove svolge la sua funzione: Nrf2 è un fattore di trascrizione della famiglia “Cap’n’collar” ed è in grado di legare una sequenza regolatrice detta “ARE” (antioxidant responsive element) presente nella regione promoter di molti geni antiossidanti tra cui la superossidodismutasi e il gene NRF2 stesso. Nella SLA è stata dimostrata una riduzione dei livelli di mRNA di Nrf2 e della rispettiva proteina nel midollo spinale dei pazienti, mentre nella corteccia motoria è aumentata l’espressione del suo inibitore Keap1. Gli attivatori di Nrf2 hanno mostrato un’azione protettiva contro lo stress ossidativo e la morte cellulare indotta dalla proteina SOD1 mutante. Infatti nei modelli murini di SLA con SOD1 mutata la sovraespressione nelle cellule gliali di Nrf2 aumenta le difese antiossidanti limitandone gli effetti tossici. In questo contesto il pathway Nrf2-ARE gioca quindi un ruolo cruciale nella regolazione dell’azione dei meccanismi antiossidanti.
L’espressione del gene NRF2 è regolata dalla sequenza ARE, facente parte del promotore genico di NRF2. Nonostante NRF2 sia un gene che si è conservato molto nel corso dell’evoluzione, sono state riscontrate diversi varianti polimorfiche nella regione promoter che potrebbero alterarne l’espressione e quindi la sua funzione di regolatore dello stress ossidativo. In particolare i polimorfismi più comuni della regione promotrice del gene NRF2 sono -653 A>G, -651 G>A, e 617 C>A.
Lo scopo del presente studio è determinare se: (1) la presenza dei polimorfismi -653 A>G, -651 G>A e 617 C>A nel promotore del gene NRF2 sia associata a SLA, (2) la presenza di polimorfismo si associ a incremento dei biomarcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli) nella SLA, (3) le eventuali alterazioni dell’espressione del gene NRF2 (in termini di concentrazione intracellulare di mRNA) e le eventuali modificazioni delle concentrazioni dei biomarcatori plasmatici di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli) in pazienti con SLA siano in relazione a polimorfismo.
Questo è uno studio retrospettivo cross-sectional su un totale di 154 individui affetti da SLA e 187 controlli sani. Lo studio è stato suddiviso in tre fasi. Nella prima abbiamo determinato la frequenza dei polimorfismi (-653 A>G, 651 G>A, 617 C>A) della regione promoter del gene NRF2 su linfociti estratti da campioni di sangue venoso nell’intera popolazione in studio (154 pazienti affetti da SLA, 187 individui sani di controllo). In una successiva fase con una sottopopolazione di 84 SLA in fase iniziale di malattia non in terapia farmacologica e 52 controlli è stata determinata la frequenza dei polimorfismi e dei dosaggi plasmatici dei biomarcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli). Infine, abbiamo quantificato l’espressione genica, in termini di mRNA intra-linfocitario, del gene NRF2 in relazione al polimorfismo -653 A>G in un ulteriore sottogruppo di 13 pazienti SLA in fase iniziale di malattia non in terapia farmacologica.
Nell’intera popolazione in studio il test t-Student non mostrava differenze significative in termini di età tra i 154 pazienti con SLA sporadica (età media 64±13,7 anni) e 187 controlli sani (età media 64,7 ±13, 7 anni) con p=0,7890. Il gruppo di pazienti con SLA presentava 61 individui di sesso femminile (39,1%) e 93 individui di sesso maschile (60,9%) mentre il gruppo di controllo 93 di sesso femminile (49,7%) e 94 individui di sesso maschile (50,3%). Il test del Χ2 mostrava differenze al limite della significatività per quanto riguarda il sesso p=0,0571. È stato quindi analizzato il genotipo dell’intera popolazione al fine di individuare la frequenza dei polimorfismi -653A>G, -651 G>A e -617 C>A nel promotore del gene NRF2. L’analisi multivariata di regressione logistica binaria applicata all’intera popolazione in studio con variabile dipendente dicotomica la presenza di SLA o meno e come variabili indipendenti quelle categoriali di sesso, polimorfismo -653 A>G, polimorfismo -651 G>A, e polimorfismo -617 C>A, è risultata statisticamente significativa con p<0,05. Il polimorfismo in eterozigosi -653 (AG) si associa in maniera statisticamente significativa a SLA con un odd ratio di 2,773 (p<0,001, IC 1,728-4,451). Inoltre anche il polimorfismo -651 (GA) si associa a SLA con un odd ratio di 1,776 (p<0,035, IC 1,040-3,035).
Nella seconda parte dello studio (sottopopolazione composta da 84 pazienti SLA e 52 controlli) l’analisi multivariata di regressione logistica binaria includente come variabile dipendente dicotomica la presenza di SLA o meno e come variabili indipendenti quelle categoriali di: polimorfismo -653 A>G, polimorfismo -651 G>A, e polimorfismo -617 C>A e le variabili quantitative AOPP, FRAP, tioli è risultata statisticamente significativa con p< 0,05. L’assetto genetico -653 AG si associa in maniera statisticamente significativa a SLA con un odd ratio di 2,999 (p>0,001, IC 1,728-4,451). Inoltre anche la concentrazione di AOPP è predittiva di SLA con un odd ratio di 1,004 (valore riferito per ogni aumento della concentrazione di mmol/ml). Invece la variabile indipendente della concentrazione di tioli plasmatici è significativamente associata al gruppo dei sani con un odd ratio di 0,023 (p=0,009). È stato effettuato un confronto delle concentrazioni di AOPP FRAP e tioli ed età tra il gruppo SLA e il sottogruppo dei controlli sani. Il test di Mann-Whitney (con p<0,01, p=0,002, p<0,001 , p=0,379 rispettivamente) ha dimostrato che non ci sono differenze significative per età (p=0,379) e che il gruppo SLA presenta concentrazioni significativamente superiori di AOPP e FRAP ed inferiori di tioli rispetto ai controlli sani. È stato effettuato all’interno del gruppo SLA un confronto delle concentrazioni di AOPP, FRAP e tioli tra il sottogruppo con genotipo -653 wild type(AA) vs -653 G-carrier (AG+GG). Il test di Mann-Whitney ha mostrato che le concentrazioni di AOPP e FRAP sono significativamente più alte nel gruppo dei G-carriers rispetto ai wild-type con p rispettivamente di 0,004 e 0,030; i tioli invece sono significativamente più alti nei wild-type rispetto ai G-carriers con p=0,047. È stato effettuato all’interno del gruppo dei controlli in salute un confronto delle concentrazioni di AOPP, FRAP ,tioli tra il sottogruppo con genotipo -653 wild type vs -653 G-carrier. Il test di Mann-Whitney (p=0,039) ha mostrato che le concentrazioni di tioli sono significativamente più basse nei G-carriers rispetto ai wild-type suggerendo che questo polimorfismo potrebbe portare ad una riduzione delle difese antiossidanti.
Nella terza fase dello studio (sottogruppo di 13 SLA in fase iniziale di malattia non in terapia farmacologica) il test di Mann-Whitney mostra che concentrazioni di mRNA di NRF2 linfocitario sono ridotte, le concentrazioni di AOPP aumentate e le concentrazioni di tioli ridotte in modo significativo nei pazienti G-carriers(AG+GG) rispetto a pazienti con genotipo wild-type (AA) (p=0,011, p=0,011 rispettivamente). In questo sottogruppo di pazienti i livelli di mRNA correlano negativamente con le concentrazioni di AOPP (ρs=-0,780 p=0,002).
Questo è uno studio esplorativo e presenta diversi fattori limitanti. Lo studio è stato concepito di natura cross-sectional di tipo retrospettivo, nel quale verifichiamo la presenza di associazioni ma non dimostriamo che queste associazioni possano essere fattori di rischio. Non sono state indagate eventuali associazioni tra i tre polimorfismi del promotore del gene NRF2 (-653 A>G, -651 G>A, -617 C>A) e particolari fenotipi di SLA (spinale, bulbare, primitivamente respiratoria piuttosto che con interessamente limitato o preponderante al motoneurone superiore o inferiore). Dovremo in futuro indagare anche una possibile associazione con la familiarità e la rapidità di progressione dei sintomi. Nel sottogruppo di 13 SLA non abbiamo dosato la quantità di proteina Nrf2 intracellulare, ma la misurazione dell’espressione genica di NRF2 ne rappresenta un valido surrogato. Il nostro campione è relativamente piccolo per ricercare l’associazione di SLA con i polimorfismi più rari che potrebbero essere anche i più patogenetici. Inoltre, nonostante il nostro gruppo di pazienti sia stato “matchato” con quello dei controlli considerando soprattutto l’età la frequenza degli individui maschi è più elevata. Tuttavia teniamo presente che il rischio di sviluppare SLA è maggiore negli individui di sesso maschile, che femminile.
In conclusione, il nostro studio mostra che i polimorfismi eterozigoti -653 A>G e, in misura minore, -651 G>A del promotore del gene NRF2 sono più frequentemente associati a pazienti con SLA. Il polimorfismo -653 A>G e biomarcatori plasmatici di stress ossidativo (incremento di concentrazione di AOPP e riduzione di tioli) sono associati a un sottogruppo di pazienti con SLA in fase iniziale di malattia non in trattamento farmacologico. Infine, il polimorfismo -653 A>G potrebbe ridurre l’espressione genica intracellulare di NRF2 e aumentare le concentrazioni plasmatiche dei biomarcatori di stress ossidativo all’interno di un piccolo campione di SLA di nuova diagnosi non in trattamento farmacologico.
In futuro, studi prospettici potranno dimostrare il possibile ruolo dei polimorfismi genetici del gene NRF2 come fattore di rischio e di progressione della SLA.