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Tesi etd-11012011-185636


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
D'AGOSTINO, SILVIA
URN
etd-11012011-185636
Title
Caratterizzazione biologica di nuovi ligandi fluorescenti capaci di legarsi irreversibilmante al TSPO.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Martini, Claudia
relatore Dott.ssa Da Pozzo, Eleonora
Parole chiave
  • fluorescenza
  • probe
  • ligandi
  • TSPO
Data inizio appello
16/11/2011;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Recentemente, l’uso di probe fluorescenti si è rivelato una valida alternativa ai metodi tradizionali di studio e di ricerca in campo biologico. <br>Fra le molecole individuate come possibili marker diagnostici risulta la proteina traslocatrice mitocondriale TSPO, alterata in diverse patologie umane incluse varie forme di tumore e neuropatologie, come gliomi, malattie neurodegenerative e neuroinfiammazioni. L’espressione di questa proteina è direttamente proporzionale alla tumorogenicità del cancro. La valutazione della sua espressione e della sua distribuzione mediante l’uso di specifiche sonde molecolari può rappresentare un importante avanzamento per la diagnosi di tali patologie.<br>Il TSPO è coinvolto in numerosi processi biologici tra cui la sintesi di steroidi, l’omeostasi del calcio, la crescita cellulare, la differenziazione degli induttori di apoptosi.<br>Recenti studi suggeriscono che, nelle cellule gliali, il TSPO può regolare la biosintesi di neurosteroidi e ciò costituisce un concetto chiave nel trattamento delle condizioni neuropatologiche.<br>Sono stati progettati fino ad ora numerosi radioligandi capaci di misurare il livello di espressione del TSPO sia sugli animali che sull’uomo. Recentemente sono state sviluppate nuove sonde fluorescenti, alternativa più sicura, veloce e meno costosa dei radioligandi.<br>Esperimenti in vitro utilizzando composti fluorescenti hanno evidenziato delle problematiche sperimentali legate al carattere reversibile del legame che si instaura tra il ligando e il TSPO. Da qui è stato necessario sviluppare un ligando caratterizzato da un’irreversibilità di legame.<br>In questo lavoro di tesi, sono stati caratterizzati biologicamente una serie di composti derivati del 2-fenilindol-3-ilgliossil-amide portanti un gruppo isotiocianato capace di legare il recettore irreversibilemente. Uno di tali composti, il composto 18, è stato inoltre progettato per poter essere una sonda fluorescente di tipo irreversibile.<br>Durante la tesi sono stati valutati i parametri di binding all’equilibrio di tali composti, seguiti da studi sulla potenziale irreversibilità del loro legame. L’affinità al TSPO dei nuovi composti indolilgliossilamidici è stata determinata sulle membrane di rene di ratto mediante studi di competizione nei confronti del [3H] Ro 5-4864. È stato quindi osservato che il processo di binding ha inizio con un primo step reversibile, seguito dalla formazione di un complesso irreversibile. Analisi cinetiche e matematiche sono state attuate per poter studiare i due step della reazione e quindi determinarne la cinetica e le costanti che definiscono il legame di tali ligandi al TSPO. Infine il composto fluorescente irreversibile è stato usato in esprimenti condotti sulla linea cellulare U87MG di glioblastoma umano per poter identificare i livelli di espressione del TSPO e valutare la capacità di tale composto di legare specificamente ed irreversibilmente il recettore target attraverso la fluorimetria. <br>I risultati ottenuti su membrana di rene di ratto, hanno dimostrato che tutti i nuovi composti si legano al TSPO mediante un’interazione covalente specifica ed irreversibile. Gli studi effettuati hanno confermato l’alta affinità, specificità ed irreversibilità del composto 18 in cellule U87MG di glioblastoma umano.<br>
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