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Tesi etd-10302010-084419


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
RICCI, DEBORA
URN
etd-10302010-084419
Title
CARATTERIZZAZIONE DEGLI EPITOPI DEGLI ANTICORPI ANTI-TIREOGLOBULINA CIRCOLANTI E VALUTAZIONE DEI METODI DI DOSAGGIO COMMERCIALI DEGLI ANTICORPI ANTI-TIREOGLOBULINA
Settore scientifico disciplinare
MED/13
Corso di studi
SCIENZE ENDOCRINE E METABOLICHE
Supervisors
tutor Prof. Vitti, Paolo
Parole chiave
  • spreading molecolare
  • thyroglobulin
  • pattern epitopico molecular spreading
  • autoimmunità tiroidea human monoclonal recombinant
  • tireoglobulina thyroid autoimmunity
  • anticorpi ricombinanti monoclonali umani epitopic
Data inizio appello
12/11/2010;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
12/11/2050
Riassunto analitico
La tireoglobulina (Tg) è uno dei principali autoantigeni tiroidei. Gli anticorpi antitireoglobulina (TgAb) sono presenti nel siero di soggetti con patologie tiroidee autoimmuni (Autoimmune Thyroid Disease -AITD) (Tiroidite cronica autoimmune o di Hashimoto -HT e Morbo di Graves o di Basedow -GD) e non autoimmuni (non-AITD) (Carcinoma Papillare -PTC e altre forme di carcinoma differenziato della tiroide- DTC e Gozzo Multinodulare Non Tossico- NTMG). I TgAb possono interferire con il dosaggio della Tg circolante, che rappresenta il marcatore dei pazienti con DTC dopo intervento di tiroidectomia, causandone una sotto- o una sovrastima. Pertanto la loro misurazione è indispensabile nei pazienti con DTC; in questi soggetti la misurazione sequenziale dei TgAb è stata proposta in alternativa a quella della Tg.
Vi sono pochi dati in letteratura sulle caratteristiche dei TgAb circolanti umani, e in particolare sulle caratteristiche dei loro epitopi. Gli anticorpi monoclonali umani sono uno strumento ideale per caratterizzare gli epitopi dei TgAb. Nel presente lavoro vengono utilizzati 4 TgAb monoclonali umani che erano stati in precedenza clonati come Fab (TgAb-Fab) mediante la tecnica della “phage display combinatory library” e che riconoscono 4 diverse regioni sulla molecola della Tg umana, che sono in parte sovrapposte e che erano state identificate come regioni A-D. Nel presente studio, mediante esperimenti di inibizione del legame alla Tg umana da parte dei TgAb-Fab, sono stati caratterizzati gli epitopi dei TgAb circolanti.
Poiché il dosaggio sequenziale dei TgAb è stato proposto in alternativa a quello della Tg nel follow-up dei pazienti con DTC, la riproducibilità dei risultati nei diversi kit commerciali dei TgAb è fondamentale. Vengono attualmente consigliati i dosaggi dei TgAb di tipo immunologico, che sono più sensibili di quelli usati in passato. Inoltre, per evitare la variabilità tra i metodi di dosaggio, viene consigliato di utilizzare nello stesso paziente sempre lo stesso metodo. Al momento non sono comunque disponibili studi di confronto tra i vari metodi di dosaggio dei TgAb disponibili in commercio.

La presente tesi comprende le seguenti sezioni:
1. Caratterizzazione del pattern epitopico dei TgAb:
a. in soggetti con AITD e non-AITD
b. in soggetti con HT di età e background genetico diversi
c. in soggetti con GD a seguito del trattamento con I-131
2. Confronto tra metodi di dosaggio dei TgAb e valutazione delle cause della discrepanza

1a. Caratterizzazione del pattern epitopico dei TgAb nei soggetti con AITD e non-AITD
Il pattern epitopico dei TgAb è stato caratterizzato nei pazienti con HT, GD, NTMG, PTC e PTC-T (PTC associato a HT). Considerando tutti i pazienti, i livelli di inibizione più elevati erano quelli indotti dal TgAb-Fab della regione A (44,9±20,9%) (media ± DS), seguiti da quelli delle regioni B, C e D. L’inibizione indotta dai 4 TgAb-Fab era simile confrontando tra loro i sieri dei pazienti con AITD (HT vs. GD) e quelli dei pazienti con non-AITD (NTMG vs. PTC). L’inibizione indotta dai TgAb-Fab della regione A, B e D, ma non quella del gruppo C era significativamente più elevata nei pazienti con AITD che in quelli con non-AITD. Per quanto riguarda i pazienti con PTC-T, il pattern di inibizione era simile a quello dei pazienti con AITD.

1b. Influenza dell’età e della genetica sul pattern epitopico dei TgAb nell’HT
Il pattern epitopico dei TgAb è stato valutato in pazienti adulti e bambini con HT provenienti da una zona geneticamente ristretta (Sardegna) e confrontato con quello di soggetti adulti con HT provenienti dalle altre regioni italiane. Non vi era alcuna differenza significativa tra il pattern epitopico dei TgAb circolanti dei soggetti Sardi adulti con HT rispetto a quello dei bambini Sardi e dei soggetti adulti provenienti dalle altre regioni italiane.

1c. Effetti sugli epitopi dei TgAb del trattamento con I-131 nel GD
Gli epitopi dei TgAb di soggetti con GD sono stati determinati prima e dopo trattamento con I-131 per valutare se la liberazione della Tg e gli effetti sulla risposta anticorpale indotti dal trattamento con I-131 modifichino le caratteristiche degli epitopi dei TgAb. Per quanto riguarda l’inibizione da parte dei singoli TgAb-Fab, quella indotta dal TgAb-Fab della regione A dopo 3 mesi dal trattamento con I-131 era statisticamente più bassa rispetto a quella pre-trattamento, mentre dopo 6 e 12 mesi dal trattamento era sovrapponibile a quella basale. Inoltre l’inibizione indotta dal pool dei 4 TgAb-Fab dopo 3 e 6, ma non dopo 12 mesi era significativamente più bassa rispetto a quella basale.

E’ possibile pertanto concludere che il TgAb-Fab della regione A identifica una regione che è immunodominante sia nelle AITD che nelle non-AITD, che il pattern epitopico dei TgAb dei pazienti con AITD differisce da quello dei pazienti affetti da non-AITD e che il pattern dei pazienti con PTC-T è simile a quello dei pazienti con AITD. Inoltre né il background genetico né l’età condizionano il pattern dei TgAb. Nei soggetti con GD il trattamento con I-131 causa uno spreading solo transitorio degli epitopi dei TgAb.

2. Confronto tra i metodi di dosaggio commerciale dei TgAb e valutazione delle cause della discrepanza
I sieri di pazienti con HT, PTC-T, PTC e di soggetti normali (NS) venivano dosati con 6 metodi di dosaggio dei TgAb, 3 immunoenzimatici (IMA) e 3 radioimmunometrici (RIA). Per valutare la loro standardizzazione, nei 6 metodi veniva dosato lo standard internazionale (SI) mentre, per confrontare la composizione di Tg e TgAb dei metodi, nei 3 kit RIA venivano misurati i 4 TgAb-Fab e infine, per valutare la capacità di riconoscere i diversi epitopi dei TgAb, i pattern epitopici dei sieri che risultavano positivi in tutti i kit (sieri “concordanti”) venivano confrontati con quelli che erano positivi in 1-5 kit (sieri “discordanti”).
I valori delle correlazioni tra i 6 kit nei vari gruppi di sieri risultavano molto variabili (tra 0 e 0,93) ed erano più elevati confrontando due kit dello stesso tipo (IMA o RIA) e più bassi confrontando kit di tipo diverso. Come conseguenza di una maggiore percentuale di positività dei TgAb nei sieri di pazienti con PTC-T rispetto a quelli di soggetti con PTC, la percentuale di sieri con Tg dosabile era più alta nel primo che nel secondo gruppo (49% rispetto a 89%). La probabilità che in un siero la Tg risultasse negativa aumentava parallelamente con l’aumento del numero di kit per i TgAb in cui il siero risultava positivo. La misurazione dello SI dei TgAb nei vari kit forniva valori molto variabili (tra 156 e 1095 UI/ml) (valore atteso: 1000 UI/mL). La misurazione dei 4 TgAb-Fab nei 3 kit RIA forniva risultati variabili e più alti per il TgAb-FAb della regione B in tutti e 3 i kit. Nei sieri discordanti i livelli di inibizione indotti dai TgAb-Fab delle regioni B e C erano significativamente più bassi rispetto a quelli indotti dai sieri concordanti, mentre erano simili per quanto riguarda il TgAb-Fab di gruppo A, che è quello dominante. Pertanto, i sieri dei pazienti con PTC-T sono più spesso positivi rispetto a quelli dei pazienti con PTC e presentano più spesso una Tg indosabile. I metodi di dosaggio dei TgAb forniscono risultati spesso contrastanti. Le cause di questa discrepanza sono molteplici: a) inadeguata standardizzazione dei kit; b) differenze nella Tg e nei TgAb utilizzati nei kit; c) eterogeneità del pattern epitopico dei TgAb circolanti.
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