• gametogenesi
• Ybox
• ibridogenesi
• Rana esculenta complex

La regolazione dell’espressione di geni specifici della linea germinale e la repressione traduzionale di RNA messaggeri immagazzinati in ovociti, spermatociti e spermatidi, assicurano un regolare svolgimento delle varie fasi della gametogenesi e garantiscono la distribuzione corretta di proteine negli appropriati stadi di sviluppo embrionale. Nel citoplasma degli ovociti di Xenopus, il mascheramento degli RNA avviene tramite il loro immagazzinamento sottoforma di ribonucleoproteine (RNP) che costituiscono fino al 5% della massa proteica totale. Le proteine mRNP3 e mRNP4/FRGY2 (Frog Y-box 2), appartenenti alla famiglia Y-box, intervengono nella stabilizzazione degli mRNA immagazzinati nel citoplasma degli ovociti di Xenopus, reprimendone la loro traduzione tramite la formazione di complessi RNP. FRGY2 contiene due domini in grado di legare gli acidi nucleici: il primo, detto CSD (Cold Shock Domain), posto in posizione amino-terminale, è un dominio conservato capace di riconoscere sequenze specifiche di RNA; il secondo, in posizione carbossi terminale, si lega invece in maniera non selettiva all'RNA. Il gene MSY2, isolato in topo, è l’omologo di FRGY2 nei mammiferi. Esso risulta implicato sia nella regolazione della trascrizione di geni testicolo-specifici sia nella repressione della traduzione di messaggeri espressi durante la spermatogenesi. Negli ovociti, MSY2 contribuisce alla stabilizzazione e alla regolazione traduzionale degli mRNA materni durante le fasi embrionali precoci.
Il sistema di studio che ho utilizzato è rappresentato da un gruppo di anfibi anuri appartenenti al Rana esculenta complex, al quale .appartengono le due specie pure Rana ridibunda e Rana lessonae dal cui incrocio naturale deriva l’ibrido fertile Rana esculenta. Questo complesso è caratterizzato dal possedere una peculiare ed interessante modalità riproduttiva definita ibridogenesi. Nelle cellule germinali dell’ ibrido Rana esculenta, i cromosomi di R. lessonae sono eliminati prima della meiosi e quelli di R. ridubunda subiscono una duplicazione premeiotica e/o meiotica, dando luogo a gameti aploidi funzionali, contenenti il genoma non ricombinato di R. ridibunda. Nonostante che non siano ancora stati chiariti i meccanismi cellulari e/o molecolari che regolano l’ibridogenesi, è stato osservato un alterato differenziamento delle cellule germinali degli ibridi rispetto alle specie parentali.
Allo scopo di intraprendere un’analisi molecolare della gametogenesi sia delle due specie parentali che dell’ibrido ibridogenetico, nel corso del mio lavoro di tesi ho isolato e caratterizzato in Rana lessonae un gene omologo alla famiglia Y-box. Utilizzando oligonucleotidi degenerati disegnati sul dominio CSD ho effettuato esperimenti di RT-PCR su RNA estratto da ovario di esemplari adulti, che mi hanno permesso di isolare un clone parziale di cDNA omologo a FRGY2. Il cDNA è stato completato tramite esperimenti di 5' RACE e 3' RACE. Infine utilizzando oligonucleotidi specifici disegnati nelle regioni 5' e 3' UTR ho così isolato il cDNA "full lenght" che è stato denominato RlYB2. L’analisi della sequenza nucleotidica mostra che RlYB2 contiene i due domini conservati di legame agli acidi nucleici tipici della famiglia Y-box.
Utilizzando come sonda il cDNA completo ho intrapreso l'analisi del pattern di espressione di RlYB2. Tecniche di ibridazione in situ whole mount e su sezioni effettuate sia in paraffina che al criostato hanno evidenziato che RlYB2 è espresso in ovociti a stadi precoci di ovogenesi. Questo risultato è infatti confermato con saggi di RT-PCR che mostrano come l’espressione sia limitata agli ovociti a stadi I-III sia nelle specie parentali che nell'ibrido.
Esperimenti di RT-PCR effettuati su RNA estratto da alcuni tessuti di esemplari adulti mostrano che il trascritto RlYB2 è presente solo nei tessuti germinali ma non in quelli somatici analizzati.