Tesi etd-10282013-105001 |
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Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica LC5
Autore
FINA, DESIRE'
URN
etd-10282013-105001
Titolo
Valutazione di nanoparticelle di polimetilmetacrilato per la veicolazione intracellulare di un oligonucleotide “molecular beacon” silenziante la survivina
Dipartimento
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Relatori
relatore Dott.ssa Adinolfi, Barbara
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
- molecular beacon
- nanoparticelle
- PMMA
- survivina
- terapia antisenso
Data inizio appello
13/11/2013
Consultabilità
Completa
Riassunto
Introduzione
Un approccio farmacologico innovativo volto a cercare di superare alcuni limiti delle terapie oncologiche convenzionali, quali la scarsa selettività verso le cellule cancerose, l’elevata tossicità e il fenomeno della drug resistance che riduce l’efficacia di tali terapie, prevede l’utilizzo di nanovettori multifunzionali in grado di veicolare farmaci, acidi nucleici, proteine o anticorpi all’interno delle cellule tumorali. In questo ambito si colloca la ricerca oggetto di questo elaborato, che rientra nel progetto multidisciplinare Nanocell, finanziato dalla regione Toscana, il quale coniuga biotecnologie e nanotecnologie. Il progetto ha previsto la veicolazione in cellule tumorali di farmaci biotecnologici a base di DNA, con possibile funzione terapeutica e diagnostica, mediante l’utilizzo di nanoparticelle. Nel presente lavoro di tesi è stato valutato, come farmaco biotecnologico, l’oligodeossinucleotide molecular beacon (ODN-MB), specifico per mRNA di survivina ed è stata studiata la capacità di nanoparticelle di polimetilmetacrilato (PMMA), fornite dai ricercatori del CNR di Bologna, di penetrare nel citoplasma di cellule tumorali in coltura.
Metodi
Mediante saggio colorimetrico WST-1, è stata, inizialmente, valutata la capacità delle nanoparticelle di PMMA, testate a differenti concentrazioni, di modificare la vitalità sulla linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano A549, al fine di decidere la concentrazione ottimale di lavoro. La capacità di entrare in cellula delle nanoparticelle è stata valutata, invece, mediante microscopia a fluorescenza e confocale, dopo opportuna coniugazione con fluoresceina delle nanoparticelle stesse. Sono stati valutati due tipi di nanoparticelle di PMMA, indicate come QTAM-02 e QTAM-03, differenti nella quantità di fluoroforo immobilizzato. La localizzazione intracellulare dei nanovettori è stata indagata tramite l’utilizzo di specifici coloranti del nucleo e di membrana cellulare.
Attraverso saggi di vitalità cellulare è stata, invece, valutata l’attività citotossica del MB 100nM, trasfettato con lipofectamina, su cellule di melanoma cutaneo A375.
La funzione come sensore del MB, è stata indagata attraverso la tecnica di dinamica in vivo, mediante visualizzazioni al microscopio confocale delle cellule A375 trasfettate con MB 100nM a 1, 3 e 6 ore.
Inoltre, è stata analizzata la specificità del MB nei confronti dell’mRNA codificante la survivina. Quest’ultima analisi è stata eseguita, al microscopio confocale, utilizzando una linea cellulare non esprimente la survivina, rappresentata dai monociti umani.
Risultati
Gli studi sulla vitalità cellulare effettuati sulle cellule A549 con i due nanovettori si sono mostrati paragonabili, portando, per entrambi, alla scelta della concentrazione 10μg/mL per i successivi test al microscopio a fluorescenza e confocale, in quanto questa risultava la più alta concentrazione in grado di non alterare significativamente la vitalità cellulare dopo 1 ora di trattamento. Le osservazioni al microscopio a fluorescenza hanno indirizzato, successivamente, la scelta verso le QTAM-03 per le ulteriori analisi al microscopio confocale, avendo esse fornito un segnale fluorescente più intenso. Le indagini di microscopia confocale, grazie anche all’ausilio di specifici coloranti per il nucleo e per la membrana cellulare, hanno dato risultati che non sembrano suggerire chiaramente una localizzazione intracellulare delle nanoparticelle, ma piuttosto una loro co-localizzazione con la membrana citoplasmatica.
I risultati ottenuti dagli studi di vitalità cellulari effettuati su cellule A375, trasfettate per 6 ore con MB 100nM, hanno mostrato una riduzione significativa della vitalità cellulare di circa il 50%, sia 24 che a 48 ore, quindi tempo-indipendente.
Le analisi effettuate al microscopio confocale hanno evidenziato, dopo un’ora di trattamento delle cellule A375 con MB 100nM, la comparsa di fluorescenza prevalentemente concentrata vicino la membrana plasmatica con aumento progressivo del segnale fluorescente localizzato all’interno delle cellule, dopo 3 e 6 ore di trasfezione. Infine, è stata verificata la specificità del MB anti-survivina effettuando il medesimo studio di dinamica in vivo sui monociti. L’osservazione al microscopio confocale dei monociti trattati con MB 100nM non evidenzia alcun segnale fluorescente, confermando l’alta specificità del MB poiché, in assenza di espressione del target survivina, il MB non emette fluorescenza.
Un approccio farmacologico innovativo volto a cercare di superare alcuni limiti delle terapie oncologiche convenzionali, quali la scarsa selettività verso le cellule cancerose, l’elevata tossicità e il fenomeno della drug resistance che riduce l’efficacia di tali terapie, prevede l’utilizzo di nanovettori multifunzionali in grado di veicolare farmaci, acidi nucleici, proteine o anticorpi all’interno delle cellule tumorali. In questo ambito si colloca la ricerca oggetto di questo elaborato, che rientra nel progetto multidisciplinare Nanocell, finanziato dalla regione Toscana, il quale coniuga biotecnologie e nanotecnologie. Il progetto ha previsto la veicolazione in cellule tumorali di farmaci biotecnologici a base di DNA, con possibile funzione terapeutica e diagnostica, mediante l’utilizzo di nanoparticelle. Nel presente lavoro di tesi è stato valutato, come farmaco biotecnologico, l’oligodeossinucleotide molecular beacon (ODN-MB), specifico per mRNA di survivina ed è stata studiata la capacità di nanoparticelle di polimetilmetacrilato (PMMA), fornite dai ricercatori del CNR di Bologna, di penetrare nel citoplasma di cellule tumorali in coltura.
Metodi
Mediante saggio colorimetrico WST-1, è stata, inizialmente, valutata la capacità delle nanoparticelle di PMMA, testate a differenti concentrazioni, di modificare la vitalità sulla linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano A549, al fine di decidere la concentrazione ottimale di lavoro. La capacità di entrare in cellula delle nanoparticelle è stata valutata, invece, mediante microscopia a fluorescenza e confocale, dopo opportuna coniugazione con fluoresceina delle nanoparticelle stesse. Sono stati valutati due tipi di nanoparticelle di PMMA, indicate come QTAM-02 e QTAM-03, differenti nella quantità di fluoroforo immobilizzato. La localizzazione intracellulare dei nanovettori è stata indagata tramite l’utilizzo di specifici coloranti del nucleo e di membrana cellulare.
Attraverso saggi di vitalità cellulare è stata, invece, valutata l’attività citotossica del MB 100nM, trasfettato con lipofectamina, su cellule di melanoma cutaneo A375.
La funzione come sensore del MB, è stata indagata attraverso la tecnica di dinamica in vivo, mediante visualizzazioni al microscopio confocale delle cellule A375 trasfettate con MB 100nM a 1, 3 e 6 ore.
Inoltre, è stata analizzata la specificità del MB nei confronti dell’mRNA codificante la survivina. Quest’ultima analisi è stata eseguita, al microscopio confocale, utilizzando una linea cellulare non esprimente la survivina, rappresentata dai monociti umani.
Risultati
Gli studi sulla vitalità cellulare effettuati sulle cellule A549 con i due nanovettori si sono mostrati paragonabili, portando, per entrambi, alla scelta della concentrazione 10μg/mL per i successivi test al microscopio a fluorescenza e confocale, in quanto questa risultava la più alta concentrazione in grado di non alterare significativamente la vitalità cellulare dopo 1 ora di trattamento. Le osservazioni al microscopio a fluorescenza hanno indirizzato, successivamente, la scelta verso le QTAM-03 per le ulteriori analisi al microscopio confocale, avendo esse fornito un segnale fluorescente più intenso. Le indagini di microscopia confocale, grazie anche all’ausilio di specifici coloranti per il nucleo e per la membrana cellulare, hanno dato risultati che non sembrano suggerire chiaramente una localizzazione intracellulare delle nanoparticelle, ma piuttosto una loro co-localizzazione con la membrana citoplasmatica.
I risultati ottenuti dagli studi di vitalità cellulari effettuati su cellule A375, trasfettate per 6 ore con MB 100nM, hanno mostrato una riduzione significativa della vitalità cellulare di circa il 50%, sia 24 che a 48 ore, quindi tempo-indipendente.
Le analisi effettuate al microscopio confocale hanno evidenziato, dopo un’ora di trattamento delle cellule A375 con MB 100nM, la comparsa di fluorescenza prevalentemente concentrata vicino la membrana plasmatica con aumento progressivo del segnale fluorescente localizzato all’interno delle cellule, dopo 3 e 6 ore di trasfezione. Infine, è stata verificata la specificità del MB anti-survivina effettuando il medesimo studio di dinamica in vivo sui monociti. L’osservazione al microscopio confocale dei monociti trattati con MB 100nM non evidenzia alcun segnale fluorescente, confermando l’alta specificità del MB poiché, in assenza di espressione del target survivina, il MB non emette fluorescenza.