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Tesi etd-10282009-112610


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
COSTANZONE, STEFANIA
URN
etd-10282009-112610
Title
Effetti di un estratto totale di radice di Echinacea pallida sull'attivita della P-glicoproteina in cellule dendritiche umane
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Nieri, Paola
Parole chiave
  • P-glicoproteina
  • cellule dendritiche
Data inizio appello
18/11/2009;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
18/11/2049
Riassunto analitico
Introduzione: L’Echinacea è una delle piante maggiormente utilizzate in fitoterapia a livello mondiale. Appartenente alla famiglia delle Asteraceae o Compositae, il genere Echinacea è composto da dieci specie, di cui solo tre attualmente usate in medicina: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea purpurea.
Sebbene siano riconosciute all’Echinacea diverse proprietà terapeutiche, le preparazioni che la contengono vengono commercializzate prevalentemente per la profilassi e la cura di malattie da raffreddamento, in virtù delle proprietà immunostimolanti dei suoi estratti.
La capacità di aumentare le risposte del sistema immunitario attualmente è stata spiegata ipotizzando l’azione su diverse componenti cellulari del sistema immunitario stesso. Non ci sono, tuttavia, ancora studi che diano una visione chiara dei meccanismi coinvolti e dei principi attivi responsabili. Fra le cellule che possono rivestire un ruolo nell’azione dell’Echinacea vi sono le cellule dendritiche (DC) su cui è stato recentemente descritto un ruolo modulatorio di un estratto totale da radici delle tre specie di Echinacea (Compagnino M, 2007).
Le cellule dendritiche (DC) rappresentano le più importanti cellule presentanti l’antigene: esse controllano sia l’inizio che il mantenimento delle risposte immuni adattative e della tolleranza immunologica. Nella maturazione e migrazione di queste cellule è stato, da alcuni Autori, proposto un ruolo della glicoproteina P (P-gp o MDR1). Si tratta di una proteina integrale di membrana, di dimensioni pari a 170 KDa, funzionante come pompa di efflusso, scoperta come responsabile del fenomeno della resistenza multifarmacologica in cellule tumorali esposte a chemioterapici, ma in seguito rinvenuta anche in molte cellule dell’organismo umano non patologiche.
Questo studio si propone di chiarire se l’estratto di Echinacea è in grado d’interferire con l’attività della P-gp in queste cellule, avendo già mostrato di farlo in altri tipi cellulari.

Materiali e Metodi: La specie di Echinacea utilizzata per questo lavoro è stata l’Echinacea pallida, più precisamente il suo estratto totale di radice, in quanto da alcuni studi è emerso essere più attiva rispetto alle altre due specie.
La concentrazione che abbiamo utilizzato è stata di 100 µg/mL, già osservata in precedenza (tesi Compagnino M) avere un effetto significativo sull’attività delle DC. senza induzione di cambiamenti morfologici e di morte cellulare delle stesse, come osservato, invece, a concentrazioni maggiori.
Le DC sono state generate in vitro a partire da monociti CD14+ circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da plasma di donatori sani, mediante centrifugazione in gradiente e successiva separazione immunomagnetica. I monociti CD14+ così ottenuti sono stati coltivati in terreno RPMI 1640 addizionato di siero fetale bovino, L-glutammina, streptomicina e penicillina. Sono stati aggiunti, inoltre, i fattori di crescita GM-CSF e IL-4, in grado di stimolare il differenziamento in cellule dendritiche mature, che si completa dopo 6 giorni. Al 6° giorno di coltura le cellule sono state, quindi, indotte a maturare mediante l’aggiunta di lipopolisaccaride (LPS), in funzione di antigene, per ulteriori 48 ore.
La presenza e l’attività della P-gp sono state valutate sia nei monociti che nelle DC. In queste ultime, l’indagine è stata ripetuta ai giorni 3 e 6 dopo contatto con i fattori di crescita (rispettivamente cellule DC immature (iDC) e mature (mDC)) e due giorni dopo l’esposizione al LPS (DC attivate (aDC)), sia in presenza che in assenza dell’estratto totale di Echinacea pallida e di un bloccante selettivo per la P-gp, il verapamile.
L’espressione della P-gp è stata verificata a livello dell’mRNA, mediante estrazione dell’RNA totale dalle cellule, successiva retrotrascrizione e amplificazione (RT-PCR).
L’attività di pompa della P-gp è stata valutata tramite l’uso di un suo substrato fluorescente, la rodamina 123 e successiva analisi fluorimetrica (spettrofluorimetro e microscopia).

Risultati e discussione: I risultati ottenuti con la RT-PCR, hanno indicato che, nelle nostre condizioni sperimentali, la P-glicoproteina è espressa sia nei monociti che in tutti gli stadi delle DC valutati.
Il saggio con rodamina 123, valutato spettrofluorimetricamente, inoltre, ha evidenziato un significativo aumento della fluorescenza dipendente dal grado di differenziamento e maturazione delle DC, con un incremento particolarmente sensibile nel passaggio dal giorno 3 al giorno 6 dopo trattamento con i fattori di crescita, quindi nel passaggio da cellule DC immature a mature. Tale risultato è, presumibilmente, da ricondursi ad una aumentata attività mitocondriale di queste ultime, ed essere in relazione al processo di biogenesi mitocondriale già riconosciuto nel differenziamento da monociti a dendritiche. Tutte le cellule mostravano di assumere e trattenere in maniera significativa il tracciante, come riscontrato con l’indagine di microscopia a fluorescenza.
L’indagine spettrofluorimetrica, tuttavia, non mostrava nessun aumento della fluorescenza in seguito ad esposizione al verapamile (20 M), noto inibitore della P-gp. Questo dato sembra suggerire che, sebbene espressa, la P-gp non svolge in queste cellule un’importante funzione di efflusso, confermando un dato suggerito da alcuni Autori in letteratura.
L’esposizione all’estratto di Echinacea, d’altro canto, riduceva sempre significativamente il segnale della rodamina 123, in accordo con una ridotta maturazione cellulare riscontrata precedentemente (Compagnino M, 2007).
In conclusione, il nostro studio: a) conferma la presenza di P-gp nelle DC e ne mostra l’espressione a tutti gli stadi (differenziamento/attivazione); b) rileva la rodamina-123 come un buon marker del differenziamento delle DC da monociti, ma non come un buon indicatore della funzionalità della P-gp in queste cellule, suggerendo l’assenza di un ruolo di pompa della P-gp stessa nelle DC; infine c) mostra un effetto inibitorio dell’Echinacea sul segnale fornito dalla rodamina-123 che merita ulteriore indagine.

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