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Tesi etd-10282009-112610


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
COSTANZONE, STEFANIA
URN
etd-10282009-112610
Title
Effetti di un estratto totale di radice di Echinacea pallida sull'attivita della P-glicoproteina in cellule dendritiche umane
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Nieri, Paola
Parole chiave
  • P-glicoproteina
  • cellule dendritiche
Data inizio appello
18/11/2009;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
18/11/2049
Riassunto analitico
Introduzione: L’Echinacea è una delle piante maggiormente utilizzate in fitoterapia a livello mondiale. Appartenente alla famiglia delle Asteraceae o Compositae, il genere Echinacea è composto da dieci specie, di cui solo tre attualmente usate in medicina: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea purpurea. <br>Sebbene siano riconosciute all’Echinacea diverse proprietà terapeutiche, le preparazioni che la contengono vengono commercializzate prevalentemente per la profilassi e la cura di malattie da raffreddamento, in virtù delle proprietà immunostimolanti dei suoi estratti.<br>La capacità di aumentare le risposte del sistema immunitario attualmente è stata spiegata ipotizzando l’azione su diverse componenti cellulari del sistema immunitario stesso. Non ci sono, tuttavia, ancora studi che diano una visione chiara dei meccanismi coinvolti e dei principi attivi responsabili. Fra le cellule che possono rivestire un ruolo nell’azione dell’Echinacea vi sono le cellule dendritiche (DC) su cui è stato recentemente descritto un ruolo modulatorio di un estratto totale da radici delle tre specie di Echinacea (Compagnino M, 2007).<br>Le cellule dendritiche (DC) rappresentano le più importanti cellule presentanti l’antigene: esse controllano sia l’inizio che il mantenimento delle risposte immuni adattative e della tolleranza immunologica. Nella maturazione e migrazione di queste cellule è stato, da alcuni Autori, proposto un ruolo della glicoproteina P (P-gp o MDR1). Si tratta di una proteina integrale di membrana, di dimensioni pari a 170 KDa, funzionante come pompa di efflusso, scoperta come responsabile del fenomeno della resistenza multifarmacologica in cellule tumorali esposte a chemioterapici, ma in seguito rinvenuta anche in molte cellule dell’organismo umano non patologiche.<br>Questo studio si propone di chiarire se l’estratto di Echinacea è in grado d’interferire con l’attività della P-gp in queste cellule, avendo già mostrato di farlo in altri tipi cellulari. <br><br>Materiali e Metodi: La specie di Echinacea utilizzata per questo lavoro è stata l’Echinacea pallida, più precisamente il suo estratto totale di radice, in quanto da alcuni studi è emerso essere più attiva rispetto alle altre due specie.<br> La concentrazione che abbiamo utilizzato è stata di 100 µg/mL, già osservata in precedenza (tesi Compagnino M) avere un effetto significativo sull’attività delle DC. senza induzione di cambiamenti morfologici e di morte cellulare delle stesse, come osservato, invece, a concentrazioni maggiori.<br>Le DC sono state generate in vitro a partire da monociti CD14+ circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da plasma di donatori sani, mediante centrifugazione in gradiente e successiva separazione immunomagnetica. I monociti CD14+ così ottenuti sono stati coltivati in terreno RPMI 1640 addizionato di siero fetale bovino, L-glutammina, streptomicina e penicillina. Sono stati aggiunti, inoltre, i fattori di crescita GM-CSF e IL-4, in grado di stimolare il differenziamento in cellule dendritiche mature, che si completa dopo 6 giorni. Al 6° giorno di coltura le cellule sono state, quindi, indotte a maturare mediante l’aggiunta di lipopolisaccaride (LPS), in funzione di antigene, per ulteriori 48 ore.<br>La presenza e l’attività della P-gp sono state valutate sia nei monociti che nelle DC. In queste ultime, l’indagine è stata ripetuta ai giorni 3 e 6 dopo contatto con i fattori di crescita (rispettivamente cellule DC immature (iDC) e mature (mDC)) e due giorni dopo l’esposizione al LPS (DC attivate (aDC)), sia in presenza che in assenza dell’estratto totale di Echinacea pallida e di un bloccante selettivo per la P-gp, il verapamile.<br>L’espressione della P-gp è stata verificata a livello dell’mRNA, mediante estrazione dell’RNA totale dalle cellule, successiva retrotrascrizione e amplificazione (RT-PCR).<br>L’attività di pompa della P-gp è stata valutata tramite l’uso di un suo substrato fluorescente, la rodamina 123 e successiva analisi fluorimetrica (spettrofluorimetro e microscopia).<br><br>Risultati e discussione: I risultati ottenuti con la RT-PCR, hanno indicato che, nelle nostre condizioni sperimentali, la P-glicoproteina è espressa sia nei monociti che in tutti gli stadi delle DC valutati. <br>Il saggio con rodamina 123, valutato spettrofluorimetricamente, inoltre, ha evidenziato un significativo aumento della fluorescenza dipendente dal grado di differenziamento e maturazione delle DC, con un incremento particolarmente sensibile nel passaggio dal giorno 3 al giorno 6 dopo trattamento con i fattori di crescita, quindi nel passaggio da cellule DC immature a mature. Tale risultato è, presumibilmente, da ricondursi ad una aumentata attività mitocondriale di queste ultime, ed essere in relazione al processo di biogenesi mitocondriale già riconosciuto nel differenziamento da monociti a dendritiche. Tutte le cellule mostravano di assumere e trattenere in maniera significativa il tracciante, come riscontrato con l’indagine di microscopia a fluorescenza.<br>L’indagine spettrofluorimetrica, tuttavia, non mostrava nessun aumento della fluorescenza in seguito ad esposizione al verapamile (20 M), noto inibitore della P-gp. Questo dato sembra suggerire che, sebbene espressa, la P-gp non svolge in queste cellule un’importante funzione di efflusso, confermando un dato suggerito da alcuni Autori in letteratura.<br>L’esposizione all’estratto di Echinacea, d’altro canto, riduceva sempre significativamente il segnale della rodamina 123, in accordo con una ridotta maturazione cellulare riscontrata precedentemente (Compagnino M, 2007).<br>In conclusione, il nostro studio: a) conferma la presenza di P-gp nelle DC e ne mostra l’espressione a tutti gli stadi (differenziamento/attivazione); b) rileva la rodamina-123 come un buon marker del differenziamento delle DC da monociti, ma non come un buon indicatore della funzionalità della P-gp in queste cellule, suggerendo l’assenza di un ruolo di pompa della P-gp stessa nelle DC; infine c) mostra un effetto inibitorio dell’Echinacea sul segnale fornito dalla rodamina-123 che merita ulteriore indagine.<br><br>
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