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La metamorfosi degli Anfibi è un processo mediante il quale un girino si sviluppa in un organismo adulto, nella maggior parte dei casi terrestre. Questo comporta profonde modificazioni morfologiche esterne accompagnate da cambiamenti fisiologici interni. In particolare, il sistema visivo subisce enormi riarrangiamenti. Nei girini gli occhi sono posti lateralmente dotando l’animale di una visione panoramica ma non binoculare. Durante la metamorfosi il cranio cambia forma e gli occhi migrano dorso-frontalmente, cambiando le relazioni spaziali tra occhi e corpo e portando un certo grado di sovrapposizione binoculare. Nel periodo di crescita embrionale tutti gli assoni delle cellule gangliari retiniche di ciascun occhio proiettano al tetto ottico ed al talamo controlaterali incrociandosi nel chiasma ottico. Alla metamorfosi si formano nuove proiezioni retino-talamiche ipsilaterali. Queste fibre derivano da nuove cellule gangliari retiniche che si originano dalla porzione ventro-temporale della retina. Infatti, questa zona durante la metamorfosi prolifera maggiormente rispetto alla porzione dorso-nasale. Negli Anfibi la crescita retinica è continua per tutta la vita dell’animale, grazie alla continua apposizione di cellule a partire da una zona localizzata alla periferia della retina, la zona del margine ciliare (CMZ). La CMZ contiene cellule staminali in continua proliferazione. Durante la metamorfosi si osserva un incremento di proliferazione della CMZ ventrale rispetto a quella dorsale, che porta ad una crescita specifica della zona ventro-temporale della retina.
Tutti i processi che avvengono durante la metamorfosi sono sotto il controllo dell’ormone tiroideo (TH). I recettori per il TH sono recettori intracellulari, che migrano dal citoplasma al nucleo in seguito al legame con l’ormone stesso e si legano ai promotori di vari geni, influenzandone la trascrizione. I geni regolati dal TH sono numerosi, e codificano per proteine strutturali e fattori di crescita. I recettori per il TH sono espressi ubiquitariamente in tutto il sistema nervoso centrale, incluso l’occhio, e non presentano differenze tra CMZ dorsale e ventrale. Recentemente è stato dimostrato la crescita asimmetrica della retina è mediata da una deiodinasi di tipo III (D3) che inattiva il TH. D3 è espressa ad alti livelli nella CMZ dorsale, e rendendo questa porzione di CMZ resistente allo stimolo proliferativo dato dal TH durante la metamorfosi. L’mRNA per D3 è presente nella CMZ dorsale da stadi di sviluppo molto precoci, molto prima che una tiroide funzionante si sia sviluppata.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare a livello molecolare il ruolo del TH nei cambiamenti retinici che avvengono alla metamorfosi, cercando di analizzare la rete genica che è alla base della sua azione.
Abbiamo quindi inizialmente caratterizzato in girini metamorfici e pre-metamorfici l’espressione di alcuni fattori di trascrizione noti per regolare la proliferazione ed il differenziamento della retina durante lo sviluppo embrionale (Xrx1, Xsix3, Xpax6, Xotx2 etc). La relazione spaziale tra l’espressione di questi geni e le specifiche cellule della CMZ in attiva proliferazione è stata analizzata associando esperimenti di ibridazione in-situ su sezioni con esperimenti di incorporazione di bromodeossiuridina. Inoltre, stiamo attualmente analizzando quali di questi geni siano sotto il controllo del TH. A questo scopo stiamo trattando girini pre-metamorfici con diverse dosi di TH, ed analizzando tramite ibridazione in situ ed RT-PCR l’espressione dei geni di interesse.
Un secondo obbiettivo è stato quello di individuare geni responsabili dell’espressione di D3 nella CMZ dorsale. Mediante microiniezione di mRNA in un singolo blastomero di embrioni a 4 cellule abbiamo sovraespresso alcuni geni coinvolti nello stabilire la polarità dorso-ventrale della retina. Abbiamo osservato che Xvax2, un fattore ventralizzante, reprime l’espressione di D3 mentre ET, un fattore dorsalazzante, ne promuove l’espressione. Questi dati indicano che gli effetti di TH sulla retina vengono programmati dal sistema retinico che determina la polarità dorso-ventrale molto prima che l’ormone venga prodotto.