ETD

• B19
• immunoneutralizzazione
• plasmaderivati
• validazione

I farmaci plasmaderivati sono medicinali prodotti dalla lavorazione industriale del plasma, componente liquida del sangue. La loro sicurezza si basa su controlli effettuati sulla materia prima e sui processi stessi di lavorazione, che includono metodi di inattivazione e rimozione virale. Tra i plasmaderivati, il Plasma trattato Solvente/Detergente (S/D) è un farmaco utilizzato nei casi di terapia intensiva in pazienti con disordini ematici e difetti della coagulazione in quanto possiede un contenuto standardizzato di fattori della coagulazione e proteine plasmatiche. Esso origina da un pool di plasma che ha subito un trattamento con il detergente Octoxinolo e il solvente tri-(N-butil)-fosfato (TNBP). Il trattamento S/D, distruggendo i lipidi di membrana, è efficace nell’inattivazione dei virus con envelope, ma non ha effetti sui virus privi di involucro, come il virus dell’Epatite A (HAV), virus dell’Epatite E (HEV) e Parvovirus B19 (B19). La sicurezza del prodotto verso di essi è garantita attraverso misure di sicurezza prese per il controllo virale (screening NAT sulle donazioni singole e sui pool, selezione dei donatori, ricerca di marker virali etc.); in particolare, la sicurezza del prodotto per quanto riguarda il rischio di infezione da B19 è assicurata applicando il test NAT per il DNA di B19 sui pool di plasma, i quali sono scartati se contengono una carica virale maggiore di 10.0 IU/µl, limite definito dalla Farmacopea Europea. In aggiunta allo screening NAT, a dare un ulteriore contributo per la sicurezza dei plasmaderivati è la presenza di anticorpi neutralizzanti verso B19 nel prodotto finito; tuttavia attualmente non è richiesto un test di screening anticorpale sui Plasma S/D e non è definito un limite minimo di anticorpi in grado di neutralizzare il Parvovirus B19.
A tal fine in questa tesi sperimentale è stato pianificato di validare un metodo per stabilire la capacità neutralizzante del Plasma S/D verso il virus B19, trovando una correlazione tra anticorpi anti-B19 (misurati tramite ELISA) e titolo neutralizzante (misurato tramite saggio di infettività in vitro), con lo scopo di introdurre, come standard volontario, un limite minimo di anticorpi anti-B19 nel prodotto finito come test di rilascio.
Il test è un saggio di infettività in vitro applicato su 3 lotti di Plasma S/D contenenti concentrazioni decrescenti di anticorpi leganti anti-B19, alle quali vengono aggiunte concentrazioni seriali di Parvovirus B19. L’immunoneutralizzazione viene valutata attraverso l’infezione delle cellule suscettibili UT7/EpoS1, seguita dall’estrazione dell’mRNA virale e amplificazione tramite RT-PCR.
In base ai risultati ottenuti negli esperimenti di validazione del test, il metodo è risultato lineare, accurato, preciso, robusto e specifico. I risultati preliminari derivati dall’applicazione del metodo ai 3 lotti di Plasma S/D dimostrano una buona capacità neutralizzante degli anticorpi anti-B19 nei confronti del virus, anche a concentrazioni anticorpali ben al di sotto delle minime quantità rilevate nel prodotto finito.