• melanoma cutaneo
• A375
• carcinoma prostatico
• LNCaP
• IK
• SK
• canali al potassio

Valutazione dell'attività antitumorale di composti modulatori dei canali al potassio calcio attivati IK e SK1-3 su cellule di melanoma cutaneo A375 e carcinoma prostatico LNCaP
Relatori: Prof.ssa Paola Nieri, Dott.ssa Barbara Adinolfi
Candidato: Banchieri Stefano
SSD: BIO/14
Introduzione Lo sviluppo della massa tumorale avviene principalmente in seguito ad alterazioni genetiche ed epigenetiche a livello cellulare; queste alterazioni inducono la trasformazione delle cellule dapprima sensibili alle tradizionali terapie farmacologiche in cellule resistenti. In questo elaborato di tesi è stata focalizzata l'attenzione su due neoplasie altamente refrattarie ai regimi chemioterapici convenzionali e con incidenza in continuo aumento a livello mondiale: il melanoma cutaneo, il più aggressivo tra i tumori della pelle (Wolchok and Saenger, 2007) e il carcinoma prostatico, che rappresenta la seconda causa di morte per malattia neoplastica nell'uomo (Sanchez et al., 2009). L'insorgenza sempre più frequente di fenomeni di resistenza è alla base della ricerca di nuovi bio-marker al fine di formulare diagnosi più precise e precoci e realizzare nuovi agenti terapeutici per lo sviluppo di una targeted-therapy (Urriticoechea et al., 2010). I canali al potassio potrebbero rappresentare un promettente player nella terapia antineoplastica visto che dati in letteratura evidenziano il loro coinvolgimento in numerosi processi cellulari quali controllo della proliferazione, differenziamento e apoptosi (Felipe et al., 2006) ed è stato riscontrato un aumento della loro espressione in molti tipi di tumore rispetto ai corrispondenti tessuti sani (Felipe et al., 2006; Li et al., 2009; Sciaccaluga et al., 2010; Faouzi et al., 2010). Nonostante in letteratura siano presenti pochi dati relativi all’espressione e al ruolo funzionale dei canali al potassio nel melanoma cutaneo e cancro prostatico, in diverse linee cellulari umane di melanoma (Tajima et al., 2011; Girault et al., 2012) e di cancro alla prostata (Lallet-Daher et al., 2009;) sono stati identificati canali al potassio calcio-attivati a intermedia conduttanza (IK) ed a bassa conduttanza (SK1-3), per i quali è stato descritto un ruolo nel controllo della crescita e progressione tumorale (Tajima et al., 2011; Girault et al., 2012).
Scopo Sulla base dei dati sopra riportati e di evidenze che indicano la capacità di bloccanti e apritori dei canali al potassio di inibire la progressione del ciclo cellulare e i processi di migrazione tumorale (Tajima et al., 2006; Debska-Vielhaber et al., 2009), nel presente elaborato di tesi è stata valutata l'attività antitumorale, su cellule di melanoma cutaneo A375 e di carcinoma prostatico LNCaP, di molecole note e originali, queste ultime fornite dall’industria farmaceutica danese NeuroSearch, in grado di modulare i sottotipi di canali in studio, IK e SK1-3. Questo nel tentativo di chiarire se queste proteine possano rappresentare un nuovo target terapeutico nelle neoplasie in studio.
Materiali e metodi Sono stati testati bloccanti e apritori selettivi e non di canali al potassio IK e SK1-3; gli effetti sulla vitalità cellulare dei composti saggiati sono stati determinati utilizzando il saggio colorimetrico WST-1 (Roche, Germany), che valuta l’attività enzimatica mitocondriale indice di vitalità cellulare. Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (5x103/well), coltivate in mezzo di coltura RPMI-1640 (10% FBS) e incubate per 24h a 37°C prima del trattamento. I bloccanti e gli apritori dei canali utilizzati nello studio son stati solubilizzati in idoneo solvente e diluiti in mezzo all’1% di FBS per ottenere le concentrazioni da testare. Tutte le molecole testate sono state saggiate in un range di concentrazione di 0.1-300 μM. L’effetto è stato valutato dopo 48h di trattamento per le cellule A375 e dopo 72h per le LNCaP. Successivamente il WST-1 è stato aggiunto in ogni pozzetto (10μL/100 μL totali), lasciato incubare a 37°C per 60 minuti e l’assorbanza misurata a 450nm. I risultati sono stati espressi come % di vitalità cellulare vs controllo non trattato e l’effetto osservato è stato espresso in termini di IC50, calcolato tramite il software GraphPad (GraphPad Software, USA).
Risultati I risultati ottenuti, espressi come IC50 (µM) sono indicati in tabella 1. CisPlatino e Temozolomide sono stati utilizzati in quanto entrambi sono farmaci di riferimento nel trattamento del melanoma cutaneo; il CisPlatino è stato valutato anche nel cancro alla prostata (Zhang et al., 2007). La scarsa risposta in vitro alla Temozolomide potrebbe essere dovuta alla rapida rimozione dei danni a carico del DNA da parte di sistemi di riparazione cellulare, il cui principale responsabile sembra essere l’enzima MGMT (O-6-methylguanine-DNA methyltransferase), in accordo con quanto riportato in letteratura (Reuland et al., 2011).
Composti Profilo farmacologico IC50(µM) A375 48h exp. n=3 IC50(µM) LNCaP 72h exp. n=1
Cis-Pt
Temozolomide Farmaco di riferimento
Farmaco di riferimento 4.32±0.04
250.86±0.86 7.28
Clotrimazolo
TRAM-34
Apamina
NS8593 Bloccante IK
Bloccante IK
Bloccante SK1-3
Bloccante SK1-3 9.88±0.36
n.d.
n.d.
51.59±3.68


40.31
1-EBIO
NS309
NS4591 Apritore IK/SK1-3
Apritore IK/SK1-3
Apritore IK/SK1-3 n.d.
61.30±1.27
64.68±2.30
4.78
9.83
Tabella 1. n.d. = non determinabile
Per quanto riguarda i canali IK, il composto risultato più attivo nel nostro modello sperimentale sulla linea A375 è stato il bloccante selettivo Clotrimazolo con una IC50 a 48 ore di 9.88±0.36µM. Questo risultato è supportato da dati in letteratura che evidenziano la capacità di questo bloccante di inibire la proliferazione cellulare su linee di melanoma murino B16F10 (Glass-Marmor and Beitner, 1997), di cancro al seno MCF-7, carcinoma polmonare LL/2 e adenocarcinoma del colon CT-26. L’altro bloccante IK selettivo, TRAM-34, pur essendo un derivato del Clotrimazolo e avendo una maggiore affinità rispetto a quest’ultimo (KdTRAM-34 = 20nM vs KdClotrimazolo= 70nM), ha dato un risultato inatteso in quanto non ha mostrato effetti inibitori sulla vitalità cellulare, a differenza di quanto riscontrato da Lee et al., 2008 su cellule di glioma U251 e U87 e di cancro epidermoide umano KB-3-1. Quanto osservato con il TRAM-34 sulla linea A375 potrebbe essere spiegato ipotizzando la capacità di tale composto di attivare i recettori per gli estrogeni, inducendo così un incremento della vitalità cellulare, in accordo con quanto riportato da Roy et al., 2010 sulla linea MCF-7 di cancro al seno. A supporto di questa ipotesi, mediante tecniche immunoistochimiche, è stata verificata la presenza di tali recettori sulla linea cellulare oggetto di studio. Ulteriori esperimenti con l’antagonista selettivo per il recettore degli estrogeni, ICI182.780, verranno realizzati al fine di confermare l’ipotesi sopra indicata ed eventualmente smascherare l’effetto inibitorio del TRAM-34 sulla vitalità cellulare. Data l’attività del Clotrimazolo, esso è stato testato anche in associazione con il CisPlatino, per valutare se questo trattamento potesse produrre dei miglioramenti in termini di riduzione della vitalità cellulare. I risultati ottenuti hanno indicato una reversione dell’effetto inibitorio indotto dal solo CisPlatino, in accordo con quanto riportato in letteratura sulla linea cellulare KB-3-1 di cancro epidermoide umano. Questo risultato potrebbe essere spiegato considerando l’importanza dei flussi ionici, in particolare dei flussi cationici, determinati anche dall’attività dei canali IK, nel modulare la risposta di cellule tumorali al CisPlatino (Lee et al., 2008). A tal proposito diverse evidenze suggeriscono come l’apoptosi di cellule tumorali indotta da CisPlatino sia ridotta in presenza di bloccanti dei canali KCa (Lee et al., 2008). La valutazione di queste molecole è in corso anche sulla linea di tumore prostatico LNCaP.
Dati in letteratura indicano un ruolo anche di alcuni apritori dei canali KCa nel controllo della vitalità cellulare (Debska-Vielhaber et al., 2009; Girault et al., 2012); per questo motivo, nella presente tesi, sono stati testati apritori IK/SK1-3 quali 1-EBIO, NS309 e NS4591. L’ 1-EBIO non ha determinato una riduzione della vitalità cellulare sulla linea A375 in accordo con quanto riportato da Lee et al., 2008. Sono attualmente in corso esperimenti sulla linea LNCaP. I dati ottenuti con le altre due molecole sono del tutto originali in quanto ad oggi non è stato ancora valutato il loro ruolo nel controllo della vitalità di cellule tumorali. Verranno comunque condotte ulteriori indagini per chiarire gli effetti osservati in seguito a trattamento con questi composti su entrambi le linee cellulari utilizzate (tabella1). I risultati ottenuti utilizzando i bloccanti SK1-3 selettivi, Apamina e NS8593, suggeriscono un ruolo anche dei canali SK nel controllo della vitalità delle cellule di melanoma e di cancro prostatico, nonostante la scarsa attività inibitoria del peptide neurotossico Apamina, che è stato in grado di ridurre la vitalità cellulare sulla linea A375 del 20% solo alla massima concentrazione testata (100µM). Questo risultato è comunque in linea con quanto riportato in letteratura su altre linee di melanoma cutaneo IGR39 e IGR1 (Tajima et al., 2006).
Conclusione I dati finora prodotti, seppure necessitino di ulteriori approfondimenti, indicano che i sottotipi di canali al potassio in studio possono costituire nuovi target terapeutici nel trattamento del melanoma cutaneo e cancro prostatico. L'azione del Clotrimazolo e la sua interferenza con il CisPlatino, seppur valutata finora solo sulle cellule di melanoma, verrà ulteriormente approfondita per cercare di spiegare i meccanismi di resistenza al chemioterapico. Per quanto riguarda la linea cellulare LNCaP, sono attualmente in corso esperimenti in analogia con quelli effettuati sulle A375, comunque i dati ottenuti su queste cellule, seppur preliminari, sembrano indicare una maggiore sensibilità al trattamento della linea prostatica rispetto a quello di melanoma.
Bibliografia
-Debska-Vielhaber G et al. J Physiol Pharmacol. 60:27-36, 2009.
-Faouzi M et al. J Membr Biol. 234:47-56, 2010.
-Felipe A et al. Cancer Detect Prev. 30:375-85, 2006.
-Girault A et al. Curr Med Chem. 19:697-713, 2012.
-Glass-Marmor L and Beitner R. Eur J Pharmacol. 328:241-48, 1997.
-Lallet-Daher et al., Oncogene. 28:1792-806. 2009
-Lee EL et al. Am J Physiol Cell Physiol. 294:C1398-C1406, 2008.
-Li H et al. Exp Cell Res. 315:2256-64, 2009.
-Reuland SN et al. PLoS One. 6:e24294, 2011.
-Roy J et al. Br J Pharmacol. 159:650-58, 2010.
-Sanchez C et al. Prostate. 69:1448-59, 2009
-Sciaccaluga M et al. Am J Physiol Cell Physiol. 299:C17584, 2010.
-Tajima N et al. J Physiol. 571:349-59, 2006.
-Tajima N et al. J Biol Chem. 286:5624-38, 2011.
-Urruticoechea A et al. Curr Pharm Des. 16:3-10, Review, 2010.
-Wolchok JD, Saenger YM. Curr Opin Oncol. 19:116-20, 2007.
-Zhang W, Cancer Letters. 255:127-34, 2007.