• modello sperimentale animale
• peptide natriuretico di tipo C
• scompenso cardiaco

Il peptide natriuretico di tipo C (CNP), appartiene alla famiglia dei peptidi natriuretici e mostra proprietà strutturali e fisiologiche simili a quelle del peptide natriuretico atriale (ANP) e del peptide natriuretico di tipo B (BNP). Il CNP è prodotto principalmente dall’endotelio e solo recentemente è stata evidenziata una sua produzione a livello cardiaco in pazienti con scompenso cardiaco (CHF). In questa situazione anche i livelli plasmatici di CNP risultano elevati in relazione alla severità della malattia, analogamente a quanto osservato per ANP e BNP, ma, mentre il ruolo patofisiologico dell’ANP e del BNP è ampiamente dimostrato, quello del CNP non è ancora completamente definito.
Lo scompenso cardiaco cronico, una sindrome clinica determinata dall’incapacità del cuore di esercitare la sua funzione di pompa in maniera adeguata alle richieste metaboliche dell’organismo, dà origine a una serie di alterazioni a livello emodinamico e neuroormonale che includono l’attivazione di molti sistemi neuroendocrini, principalmente il sistema nervoso adrenergico e il sistema renina-angiotensina-aldosterone e altri sistemi vasoattivi, quali quello delle endoteline e dei peptidi natriuretici.
Sebbene sia stata dimostrata una produzione miocardica di CNP in pazienti con CHF, non è ancora stato determinato il sito di produzione del peptide e le eventuali differenze tra produzione atriale e ventricolare.
Scopo di questa tesi è stato valutare il ruolo del CNP nel CHF in un modello sperimentale animale di maiale con insufficienza cardiaca cronica indotta da stimolo con pace-maker ad alta frequenza; per questo sono stati determinati i livelli plasmatici di CNP e l’espressione cardiaca, a livello di mRNA e di proteina, del peptide e del suo recettore biologico specifico, NPR-B.
Materiali e Metodi: Sono stati studiati complessivamente 10 animali da esperimento (minipig, maschi adulti, 35-40 kg). Ad ogni animale sottoposto a esperimento (n=5) è stato applicato un pace-maker unipolare nella parete ventricolare sinistra e lo scompenso cardiaco è stato indotto stimolando l’animale per 4 settimane (180 battiti/min). La condizione clinica è stata valutata tramite tecniche ecocardiografiche, Tomografia ad Emissione di Positroni e Risonanza Magnetica. Come controllo (n=5) sono stati utilizzati minipig adulti, non sottoposti ad alcun trattamento e mantenuti nelle stesse condizioni degli animali sottoposti a stimolazione cardiaca.
I campioni di sangue sono stati raccolti in EDTA e aprotinina prima (basale) e a 10 min, 1, 2, 3 e 4 settimane dall’applicazione dello stimolatore cardiaco mentre i campioni di tessuto cardiaco (atrio e ventricolo, destro e sinistro), sono stati raccolti al termine dell’esperimento. Le proteine e l’mRNA sono stati estratti dallo stesso campione di tessuto cardiaco con il metodo del fenolo/guanidina-tiocianato/cloroformio. L’espressione cardiaca dell’mRNA codificante per il CNP, per l’ NPR-B, e come controllo per il BNP (di cui è ben nota l’espressione a livello cardiaco), è stata determinata con RT-PCR dopo opportuna messa a punto del metodo. I livelli plasmatici di CNP, nel plasma e negli estratti cardiaci, sono stati determinati con un metodo radioimmunologico specifico dopo preliminare estrazione in fase solida su Sep-Pak C18.
Risultati: L’affidabilità dell’analisi tramite RT-PCR semiquantitativa nel tessuto cardiaco di maiale è stata valutata per ciascun effettore con prove sperimentali dedicate. L’espressione dello mRNA codificante per il CNP è risultata indotta dopo scompenso cardiaco in parallelo con quella del BNP, sebbene i livelli di CNP siano circa 10 volte inferiori.
Nel corso di questo lavoro di tesi è stato sequenziato l’mRNA codificante per il recettore NPR-B di maiale (GenBank DQ 487044; 1-396 pb) mancante nella GenBank, usando primer di Mus musculus per l’NPR-B, grazie alla alta omologia fra specie. Il recettore NPR-B è risultato espresso nelle diverse camere cardiache sia negli animali di controllo che in quelli scompensati, confermando la presenza di questo recettore nel tessuto cardiaco di maiale.
I livelli plasmatici di CNP sono risultati significativamente aumentati rispetto ai controlli a partire dalla prima settimana 36,9 ± 10,4 vs 16,7 ± 1.1 pg/ml, media ± sem, p=0.013. Per quanto riguarda gli estratti tissutali, in condizioni basali livelli misurabili di CNP sono stati trovati in tutte le camere cardiache; la concentrazione osservata negli atrii (dx: 13,68±1,9 pg/mg; sin: 8,7±3,76) è risultata circa 10 volte più elevata rispetto ai ventricoli (dx:1,07±0,33; sin: 0,93±017). Dopo 4 settimane di stimolazione con pace-maker ad alta frequenza, i livelli miocardici di CNP sono risultati aumentati particolarmente nel ventricolo sinistro (15,8±9,9 vs 0,9±0.17, p=0,01).
Conclusioni: Questi dati indicano che il CNP e il suo recettore biologico hanno un ruolo rilevante nella patofisiologia dello scompenso cardiaco, sebbene ulteriori studi siano necessari per la completa definizione della funzione di questo peptide nel CHF. In particolare, la conoscenza della sequenza del NPR-B nel maiale potrebbe costituire un importante strumento per studiare il coinvolgimento di questo recettore nella regolazione di varie patologie che possono essere studiate con questo tipo di modello animale.