• epc caratterizzazione isolamento

Nell'essere umano adulto la formazione dei vasi sanguigni avviene attraverso meccanismi di angiogenesi e vasculogenesi. Il termine vasculogenesi si riferisce a processi che avvengono sia durante l'embriogenesi, mediante il differenziamento degli angioblasti in cellule endoteliali mature capaci di dare origine a una primitiva rete vascolare, che nell'adulto. Un ruolo chiave in questo processo è rappresentato dalle cellule progenitrici endoteliali (EPC). Le EPCs sono cellule circolanti nel sangue, capaci di proliferare e partecipare alla formazione di nuovi vasi mediante differenziamento in cellule endoteliali mature (ECs). Prove sperimentali hanno suggerito il coinvolgimento di queste cellule anche nei processi patologici di angiogenesi tumorale, di vasculogenesi nei tessuti ischemici e di omeostasi vascolare. Asahara et al. fu il primo nel 1997 a dimostrare l'esistenza delle EPCs, isolando dal sangue periferico una popolazione di cellule progenitrici CD34+ e VEGFR-2+, capaci di aderire alla fibronectina, di acquisire caratteristiche di ECs in vitro e di contribuire alla neoangiogenesi in vivo (A.Y. Khakoo, T. Finkel, 2005; A. Zampetaki et al, 2008; L.B. Khzam et al, 2015). A dispetto del potenziale diagnostico e terapeutico mostrato da queste cellule nei test preclinici, altri studi sono necessari per chiarire l'origine e le specifiche funzioni di queste cellule, così da convertire il potenziale di queste cellule in un’efficace terapia medica. Una delle sfide maggiori rimane quella di trovare un protocollo standardizzato e ufficialmente riconosciuto che permetta di isolare e caratterizzare in modo univoco queste cellule.
Sulla base di queste considerazioni, il lavoro condotto nella presente tesi di laurea si è focalizzato nell’individuazione e ottimizzazione di un protocollo di isolamento e caratterizzazione delle cellule progenitrici endoteliali di ratto. A tale fine sono state prese in esame ed applicate due distinte metodiche a partire dal sangue periferico e dalla milza, che sono indicate dalla letteratura come le principali fonti, insieme al midollo osseo, per l’estrazione di queste cellule. Una parte del lavoro è stata dedicata al confronto tra questi due protocolli di isolamento, evidenziando le differenze tra le EPCs ottenute dal sangue periferico e quelle ottenute dalla milza. Infine, l’ultima parte dello studio si è concentrata invece sulla caratterizzazione del fenotipo delle EPCs attraverso tecniche di immunofluorescenza, per confermarne l’isolamento a partire dalle cellule mononucleate del sangue e della milza. In conclusione, le cellule sono state isolate, sia dal sangue che dalla milza, e caratterizzate con immunofluorescenza. Le colture di EPCs provenienti dal sangue presentavano un minor numero di detriti cellulari rispetto a quelle ottenute dalla milza e sono state più facilmente caratterizzate. Tuttavia, confrontando i due protocolli, lo studio ha evidenziato che l’isolamento a partire dalle cellule mononucleate della milza si è dimostrato il migliore perché permette di ottenere una popolazione omogenea di cellule progenitrici endoteliali, mentre l’isolamento dalle cellule mononucleate del sangue porta a colture di EPCs in cui permane anche la popolazione leucocitaria.