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Tesi etd-10242013-150303


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
CARRABOTTA, DENISE
URN
etd-10242013-150303
Title
Saggio immunoenzimatico "home made" per la valutazione dell'interazione proteina-proteina
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
correlatore Dott.ssa Zappelli, Elisa
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
Parole chiave
  • interazione proteina-proteina
  • GPR17
  • saggio ELISA
Data inizio appello
13/11/2013;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le interazioni proteina-proteina e la formazione di complessi multiproteici sono meccanismi fondamentali in molti processi biologici, quali la trasmissione dei segnali provenienti dall&#39;esterno, l&#39;adesione cellulare, lo sviluppo e la comunicazione tra cellule. Lo sviluppo di nuove metodologie biochimiche capaci di misurare quantitativamente e in maniera rapida ed efficace l&#39;interazione proteina-proteina rappresenta un campo di ricerca di alto interesse. Fino ad ora la tecnica maggiormente usata per lo studio dell&#39;interazione proteina-proteina è quella della<br>co-immunoprecipitazione (co-IP) e il western blot. In tale metodica si precipita una proteina mediante un anticorpo specifico e si va a ricercare la presenza di una seconda proteina nell&#39;immunoprecipitato tramite immunomarcatura. Tale metodica, oltre ad essere abbastanza lunga e costosa, dà un&#39;indicazione solamente qualitativa o semiquantitativa dell&#39;interazione tra due proteine. Da qui lo scopo di questa tesi, è stato quello di sviluppare un saggio immunoenzimatico per quantizzare in maniera sensibile e rapida l&#39;interazione proteina-proteina. Sulla base di attuali ricerche, svolte presso i laboratori di biochimica di questo dipartimento, incentrate sullo studio dei meccanismi di regolazione del recettore GPR17, abbiamo messo a punto tale metodo studiando le interazioni tra questa proteina recettoriale taggata con HA-Tag (human influenza hemagglutinin) e trasfettate in cellule di astrocitoma umano (1321N1), e le proteine intracellulari di regolazione del segnale. <br>Il saggio immunoenzimatico messo a punto prevede i seguenti steps: <br>1.le piastre vengono trattate con un anticorpo diretto contro l&#39;epitopo HA-Tag del recettore in modo da far absorbire l&#39;anticorpo alla piastra<br>2.viene messo in incubazione, in tali piastre, il lisato cellulare. Il recettore GPR17 taggato con HA-Tag andrà a legarsi all&#39;anticorpo adeso sulla piastra<br>3.dopo appositi lavaggi atti a rimuovere l&#39;eccesso di proteina non legata, le piastre vengono trattate con un anticorpo diretto contro la seconda proteina, supposta interagire con il GPR17<br>4.si elimina l&#39;anticorpo in eccesso e si trattano le piastre con un anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano<br>5.l&#39;aggiunta quindi di un substrato della perossidasi, il TMB (3,3&#39;,5, 5&#39; Tetrametilbenzidina), innesca la reazione enzimatica: H2O2 + substrato ridotto → 2 H2O + substrato ossidato, e lo sviluppo di una colorazione blu che viene quantizzata allo spettofotometro alla lunghezza d&#39;onda di 450 nm.<br>Tramite questi saggi abbiamo studiato la fosforilazione del GPR17, la sua associazione con le proteine chinasi GRK2 e GRK5 e con le proteine di regolazione del segnale β-arrestine in risposta a ligandi purinergici e leucotrienici.<br>La comparazione dei dati ottenuti con quelli ricavati dalle classiche tecniche di immunoprecipitazione e Western Blot, ci ha permesso di validare tale metodo come alternativa rapida, efficiente e “a ridotto costo” nella determinazione dell&#39;interazione proteina-proteina.
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