• GPR17
• interazione proteina-proteina
• saggio ELISA

Le interazioni proteina-proteina e la formazione di complessi multiproteici sono meccanismi fondamentali in molti processi biologici, quali la trasmissione dei segnali provenienti dall'esterno, l'adesione cellulare, lo sviluppo e la comunicazione tra cellule. Lo sviluppo di nuove metodologie biochimiche capaci di misurare quantitativamente e in maniera rapida ed efficace l'interazione proteina-proteina rappresenta un campo di ricerca di alto interesse. Fino ad ora la tecnica maggiormente usata per lo studio dell'interazione proteina-proteina è quella della
co-immunoprecipitazione (co-IP) e il western blot. In tale metodica si precipita una proteina mediante un anticorpo specifico e si va a ricercare la presenza di una seconda proteina nell'immunoprecipitato tramite immunomarcatura. Tale metodica, oltre ad essere abbastanza lunga e costosa, dà un'indicazione solamente qualitativa o semiquantitativa dell'interazione tra due proteine. Da qui lo scopo di questa tesi, è stato quello di sviluppare un saggio immunoenzimatico per quantizzare in maniera sensibile e rapida l'interazione proteina-proteina. Sulla base di attuali ricerche, svolte presso i laboratori di biochimica di questo dipartimento, incentrate sullo studio dei meccanismi di regolazione del recettore GPR17, abbiamo messo a punto tale metodo studiando le interazioni tra questa proteina recettoriale taggata con HA-Tag (human influenza hemagglutinin) e trasfettate in cellule di astrocitoma umano (1321N1), e le proteine intracellulari di regolazione del segnale.
Il saggio immunoenzimatico messo a punto prevede i seguenti steps:
1.le piastre vengono trattate con un anticorpo diretto contro l'epitopo HA-Tag del recettore in modo da far absorbire l'anticorpo alla piastra
2.viene messo in incubazione, in tali piastre, il lisato cellulare. Il recettore GPR17 taggato con HA-Tag andrà a legarsi all'anticorpo adeso sulla piastra
3.dopo appositi lavaggi atti a rimuovere l'eccesso di proteina non legata, le piastre vengono trattate con un anticorpo diretto contro la seconda proteina, supposta interagire con il GPR17
4.si elimina l'anticorpo in eccesso e si trattano le piastre con un anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano
5.l'aggiunta quindi di un substrato della perossidasi, il TMB (3,3',5, 5' Tetrametilbenzidina), innesca la reazione enzimatica: H2O2 + substrato ridotto → 2 H2O + substrato ossidato, e lo sviluppo di una colorazione blu che viene quantizzata allo spettofotometro alla lunghezza d'onda di 450 nm.
Tramite questi saggi abbiamo studiato la fosforilazione del GPR17, la sua associazione con le proteine chinasi GRK2 e GRK5 e con le proteine di regolazione del segnale β-arrestine in risposta a ligandi purinergici e leucotrienici.
La comparazione dei dati ottenuti con quelli ricavati dalle classiche tecniche di immunoprecipitazione e Western Blot, ci ha permesso di validare tale metodo come alternativa rapida, efficiente e “a ridotto costo” nella determinazione dell'interazione proteina-proteina.