• glicosidi
• oligosaccaridi
• Streptococcus Pneumoniae 14
• zwitterioni

I carboidrati, oltre a sovrintendere a numerosi processi biologici, sono responsabili della risposta immunogenica alle infezioni causate da molti batteri patogeni provvisti di capsule polisaccaridiche (CPS) capaci di indurre la produzione di anticorpi e conferire, quindi, una protezione antibatterica specifica. I principali problemi associati ai vaccini polisaccaridici naturali, ottenuti per lisi controllata delle capsule batteriche, sono dovuti ad una risposta immunitaria debole in bambini e anziani a causa di una risposta anticorpale T-indipendente, incapace quindi di stimolare i linfociti T, responsabili della memoria immunologica. Questo limite è stato in parte superato mediante coniugazione dei CPS nativi o loro frammenti con una proteina immunogenica. L’uso dei vaccini saccaridici naturali coniugati è comunque limitato dalla loro micro-eterogeneità strutturale presente nei differenti serotipi della stessa specie, dalla presenza di contaminanti biologici e anche da una possibile ipersensibilità verso la proteina carrier. Nell’ultimo decennio la ricerca si è orientata verso lo sviluppo di metodologie sintetiche volte alla preparazione di strutture poli- o oligosaccaridiche, chimicamente definite e prive di contaminanti biologici, come potenziali vaccini anti-batterici. Studi recenti hanno evidenziato che i CPS di batteri come Bacteroidies fragilis, Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae tipo 1, caratterizzati dalla presenza di una distribuzione zwitterionica di cariche sulle unità ripetitive dei loro polisaccaridi capsulari (ZPS), possiedono una specifica attività immunostimolatoria T-dipendente in quanto la loro natura zwitterionica permette una stimolazione diretta dei linfociti T mediante processazione e presentazione dell’antigene (APCs) attraverso il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II. Questi risultati hanno aperto la strada a nuove ricerche nel campo dei vaccini sintetici ed in particolare allo sviluppo di metodologie volte a realizzare la trasformazione dei polisaccaridi CPS neutri o loro frammenti in strutture zwitterioniche. Ciò potrebbe avere notevoli implicazioni sia nella progettazione di nuovi vaccini saccaridici che mantengano la specificità immunogenica dell’antigene nativo e sia per chiarire il meccanismo attraverso cui gli ZPS (naturali o di sintesi) inducono una risposta anticorpale T-dipendente.
Fra i CPS neutri quelli che costituiscono la capsula batterica dello Streptococcus Pneumoniae (SP) risultano molto interessanti per l’alta incidenza della malattia pneumococcica a livello mondiale che rappresenta una delle principali cause di mortalità infantile nei paesi in via di sviluppo. Fra i 90 ceppi di SP attualmente noti, uno dei più virulenti è quello di tipo 14 (SP14) e per il quale è noto che l’unità ripetitiva tetrasaccaridica {6)-[-D-Galp-(1→4)]--D-GlcpNAc(1→3)-[-D-Galp-(1→4)]--D-Glcp-(1→}n costituisce l’unità minima capace di indurre, una volta coniugata ad una proteina immunogenica, una risposta anticorpale specifica contro Sp14.
Il lavoro svolto in questa tesi si inserisce in un più ampio progetto di ricerca volto alla sintesi di derivati neutri, anionici, cationici e zwitterionici dell’unità ripetitiva del CPS di SP14. In particolare l’obiettivo della tesi ha riguardato la preparazione del derivato anionico 4 e zwitterionico 5 (Figura 1) che insieme ai tetrasaccaridi (1, 2, 3), precedentemente preparati in Laboratorio, saranno sottoposti ai test di valutazione delle eventuali proprietà immunogeniche. I risultati biologici forniranno utili informazioni sull’influenza dei diversi inserimenti di carica all’interno del frammento tetrasaccaridico sulla specificità immunogenica verso Sp14.

Figura 1


La sintesi dei tetrasaccaridi 6a e 6b (Schema 1), precursori dei corrispondenti derivati deprotetti 4 e 5 (Figura 1) ha previsto la preparazione di building blocks disaccaridici del lattosio (7a,b) e della lattosamina (8a,b) da usare, rispettivamente come glicosil donatori e glicosil accettori in una -glicosidazione stereoselettiva. Tali derivati presentano nella struttura un gruppo precursore del centro anionico, tipo estere benzilico, o di un gruppo cationico come il gruppo azidico. Mentre i donatori 7a,b sono facilmente ottenibili dal lattosio, la sintesi degli accettori 8a,b ha previsto la preparazione dei glicosil accettori 4-OH--D-glucosammici (11a,b) seguita da -galattosidazione con i donatori 10a,b e rimozione selettiva del gruppo t-butildimetilsilico in posizione 6.

Schema 1


Mentre il donatore lattosidico 7a, noto il letteratura, è disponibile in laboratorio, il derivato tricloroacetoimmidato 7b è stato preparato (Schema 2) a partire dal noto derivato lattosidico 9a, avente un gruppo alcolico primario sull’unità non riducente, che ha permesso di realizzare l‘ossidazione ad unità uronica con il sistema TEMPO/NaHCO3/NaOCl in acetone. La successiva esterificazione dell’acido carbossilico con BnBr ha fornito l’estere benzilico 9b (resa 95%) che è trasformato nell’-tricloroacetoimmidato 7b, previa rimozione delle funzioni acetaliche (AcOH 80%, 80°C), acetilazione convenzionale (Py-Ac2O) a dare 12, deprotezione selettiva della posizione anomerica (NH2NH2.AcOH, DMF, 60°C) e successivo trattamento con CCl3CN in presenza di DBU (resa globale 60%).

Schema 2


La sintesi del glicosil accettare 4OH--D-glucosamminco 11b (Schema 3) avente in posizione anomerica un gruppo propilazidico, precursore del centro cationico, è stata realizzata attraverso una metodologia messa a punto in laboratorio nella preparazione dell’analogo metilico 11a. Precursore chiave della sintesi di 11b è l’-ossazolidina 13 efficacemente preparata (resa 95%) a partire dal cloridrato della D-gucosammina commerciale previa acetilazione (Py-Ac2O) seguita da trattamento con un promotore acido (TMSOTf) in DCE anidro. L’apertura nucleofila regioselettiva di 13 con 3-O-tosil-1,3-propandiolo in presenza di un catalizzatore acido (CSA) in DCM anidro ha fornito il β-glicoside 14 (resa 53%) che è convertito nell’azide 15 per sostituzione nucleofila SN2 del tosile con un gruppo azidico (NaN3, DMF, TBAI). La completa rimozione dei gruppi esterei (MeONa-MeOH) seguita da selettiva isopropilidenazione in posizione 4,6 (2-MP, CSA, DCM) a dare 16, benzilazione della posizione 3 (BnBr, KOH, THF, 18-crown-6) e successiva rimozione del’acetonuro per idrolisi acida blanda (AcOH aq 70%, 40°C) fornisce il diolo 17 (resa totale 47%). La successiva trasformazione di 17 nell’accettore 11b (resa 80%) è realizzata per trattamento con t-butildimetilsililcloruro (TBDMSCl, Py), un reagente ingombrante che consente la protezione regioselettiva del più reattivo ossidrile primario.

Schema 3:

Mentre il donatore galattosidico 10a, noto il letteratura, è disponibile in laboratorio, il derivato tricloroacetoimmidato 10b è stato preparato (Schema 4), a partire dal diacetongalattosio 18 commerciale, applicando la stessa metodologia utilizzata nella sintesi del donatore 7b, previa ossidazione del gruppo alcolico primario di 18 ad acido carbossilico seguita da esterificazione con BnBr.

Schema 4


La sintesi degli accettori lattosamminici 8a,b è stata realizzata utilizzando le condizioni di glicosidazione messe a punto in ricerche precedenti nell’ambito della sintesi dei tetrasaccaridi 1-3.4 La β-galattosidazione di 11a (Schema 5) condotta con un eccesso (1.5 eq) di donatore 10a, TMSOTf come promotore acido, in DCM anidro e in presenza di setacci molecolari (AW-300) ha fornito il disaccaride 22 (resa 40%). La rimozione selettiva della protezione silileterea sul C-6 di 22 mediante idrolisi acida blanda (AcOH aq. 70%, 70°C) fornisce l’accettore lattosamminico 8a in buona resa (resa 80%).

Schema 5


La reazione di glicosidazione tra il donatore estereo 10b e l’accettore 11b utilizzando i più comuni metodi di attivazione dei tricloroacetoimmidati (TMSOTf, BF3.Et2O) non ha fornito il disaccaride desiderato 23, per la bassa reattività del donatore. Per ovviare a questo inconveniente ci siamo indirizzati verso la -galattosidazione di 11b, con il donatore 21 (Schema 5), facilmente preparabile da 18 (Schema 4) dopo allilazione al C-6 a dare 19a e successiva attivazione della posizione anomerica come tricloroacetoimmidato in analogia a quanto descritto per 10b. La reazione di glicosidazione fra 11b e 21, condotta secondo quanto descritto nella preparazione di 8a, ha fornito il disaccaride 24 (resa 79%), precursore di 8b, previa deprotezione al C-6’ seguita da ossidazione del gruppo alcolico primario, esterificazione con BnBr e rimozione del gruppo t-butildimetilsilico in posizione 6.
L’ultimo passaggio chiave della sequenza sintetica per ottenere il tetrasaccaride anionico 4 ha previsto la reazione di glicosidazione fra l’accettore lattosamminico 8a e il donatore 7a (Schema 6) utilizzando come promotore acido il BF3.Et2O e conducendo la reazione in DCM anidro a temperatura ambiente. In queste condizioni è stato isolato tetrasaccaride 6a in ottima resa (87%).

Schema 6


La completa rimozione dei gruppi protettori presenti in 6a, realizzata attraverso debenzilazione catalitica (H2, Pd/C 10%, MeOH-AcOEt 2.5:1) seguita da trattamento basico con NH3/MeOH 3.5N ha fornito il tetrasaccaride anionico 4, ottenuto puro dopo cristallizzazione da isopropanolo-MeOH.
Tutti i composti sintetizzati in questa tesi, non riportati in letteratura, sono stati completamente caratterizzati dal punto di vista chimico fisico e i dati NMR, ricavati utilizzando tecniche mono e bi-dimensionali (1H, 13C, DEPT-135, COSY e HETCOR) sono in accordo con le strutture proposte.
Con l’ottenimento del derivato 4 e del disaccaride 24 è stato raggiunto l’obiettivo prefissato in questo lavoro di tesi. Mentre il disaccaride 24 sarà utilizzato in ricerche successive volte alla preparazione del tetrasaccaride zwitterionico 5, i tetrasaccaridi 1, 2, 3 e 4 sono stati inviati alla Prof.ssa Lombardi dell’Università degli Studi del Piemonte Orientale, che effettuerà gli opportuni test biologici volti a determinarne l’attività immunogenica contro le infezioni da Streptococcus Penumoniae 14 (Sp14).