• ssh
• contextual fear conditioning

Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca finalizzato ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi nell’amigdala e nell’ippocampo di ratti addestrati con il contextual fear conditioning.
In questo test comportamentale,l’animale viene inserito nell’apparato di condizionamento(Skinner box) e sottoposto ad un training di 7 scosse elettriche(ciascuna dell’intensità di 1 mA e della durata di 1 secondo) intervallate 30 secondi l’una dall’altra. Gli animali addestrati mostrano una risposta di freezing ogni volta che sono inseriti nella Skinner box.
E’ noto che il contextual fear conditioning richiede l’attivazione dell’amigdala e dell’ippocampo e provoca modificazioni dell’espressione genica a livello di queste due regioni.
Per valutare tali modifiche del pattern di espressione genica si utilizza la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva(suppression subtractive hybridisation,SSH).Questo metodo permette di ottenere l’isolamento delle sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame,tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA. Inoltre,l’SSH è particolarmente efficiente nell’isolare sequenze poco espresse,non identificabili con altre tecniche che analizzano pattern di espressione genica.
In questo lavoro sperimentale,abbiamo utilizzato un gruppo di ratti sottoposto a contextual fear conditioning ed un altro gruppo di controlli(animali mai entrati nell’apparato di condizionamento”naive”).A 48 ore di distanza dal condizionamento,sono stati sacrificati sia gli animali sperimentali,sia quelli di controllo;in seguito i loro cervelli sono stati estratti e sezionati ciascuno in tre parti:lobo anteriore,lobi medio-temporali e cervelletto. Abbiamo utilizzato solo i lobi medio-temporali,comprendenti ippocampo e amigdala,da cui poi è stato isolato l’RNA totale.
Per una produzione efficiente di cDNA per l’allestimento di una libreria risulta molto utile purificare l’mRNA(1-5% del totale).
L’utilizzo del PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit permette di costruire una libreria forward ed una riverse rispettivamente costituite dai trascritti indotti,disattivati o modulati n seguito al contextual fear conditioning.
Dopo aver valutato l’efficienza di sottrazione,i cDNA vengono clonati e sottoposti a screening. I cloni ottenuti vengono sequenziati per mezzo di un sequenziatore automatico e vengono successivamente identificati utilizzando le banche dati presenti in rete(programmi FASTA,BLASTX e BLASTIN).La reale espressione differenziale viene poi analizzata mediante Northern Blot e RT-PCR relativa.