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Thesis etd-10232018-104837


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
MARINI, SILVIA
URN
etd-10232018-104837
Thesis title
Caratterizzazione di un modello di perdita di funzione del gene setd5 in zebrafish: effetti sullo sviluppo del sistema nervoso centrale di larve e adulti
Department
BIOLOGIA
Course of study
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Prof. Andreazzoli, Massimiliano
relatore Dott.ssa Gabellini, Chiara
Keywords
  • autismo
  • CRISPR/Cas9
  • setd5
  • sistema nervoso centrale
  • zebrafish
Graduation session start date
10/12/2018
Availability
Withheld
Release date
10/12/2088
Summary
L’autismo è una grave patologia del neuro-sviluppo dovuta a fattori genetici, ambientali e alla loro interazione. Data l’estrema variabilità della sintomatologia e la complessità delle cause che ne determinano l’insorgenza, si parla di disturbi dello spettro autistico (ASD), i quali comprendono sindromi che hanno come denominatore comune peculiari caratteristiche comportamentali. Gli individui affetti manifestano, sin dalla prima infanzia, difficoltà comunicative, mancanza di interazione sociale, interessi in attività ristrette e ripetitive. Ad oggi, mutazioni a carico di geni coinvolti nella morfogenesi delle sinapsi, nel differenziamento neuronale, nel turnover e nella sintesi di determinate proteine, sono state associate ad un aumento del rischio di ASD. Di recente, mutazioni del gene SETD5 che ne determinano perdita di funzione, quali mutazioni frameshift, nonsenso e varianti di splicing, sono state identificate come cause genetiche correlate all’insorgenza di ASD e disabilità intellettive (ID). Il gene SETD5 nell’uomo mappa nel braccio corto del cromosoma 3 e gli individui affetti dalla Sindrome da microdelezione 3p25.3, nei quali il gene SETD5 risulta interamente deleto, presentano dismorfismo facciale, ID, microcefalia, ipotonia e difetti cardiaci. SETD5 codifica per una proteina la cui funzione è ancora sconosciuta, ma si presume che si tratti di un istone metil-transferasi per la presenza di un dominio SET, che catalizza la metilazione di residui di lisina degli istoni H3 e H4, e un dominio PHD (Plant homeodomain) che riconosce e lega in maniera specifica residui istonici di lisina e arginina metilati. Queste caratteristiche della proteina SETD5 suggeriscono un suo possibile ruolo come regolatore cromatinico nell’espressione genica. Studi recenti sul topo, dimostrano che la proteina Setd5 è in grado di regolare lo sviluppo vascolare ed il differenziamento della linea germinale, mentre non è stato ancora caratterizzato il suo ruolo nello sviluppo del sistema nervoso centrale.
Lo scopo del seguente lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare un modello mutante di setd5 in zebrafish, studiando l’effetto della perdita di funzione del gene sia a stadi precoci dello sviluppo sia nel pesce adulto, ponendo particolare attenzione allo sviluppo del sistema nervoso centrale.
Nel laboratorio ospitante, sono state recentemente generate linee di zebrafish caratterizzate da mutazioni nell’esone 7 del gene setd5, ottenute mediante la tecnica CRISPR/Cas9. In particolare, mediante il sequenziamento Sanger, sono stati individuati diversi tipi di mutazioni ed il mio lavoro di tesi si è concentrato sulla caratterizzazione dell’effetto di una delezione di 8 nucleotidi, la quale rappresenta una mutazione frameshift con l’insorgenza di un codone di stop prematuro e una conseguente perdita di funzione della proteina Setd5. Gli individui eterozigoti per la mutazione nel gene setd5 della generazione F1 erano stati incrociati per ottenere individui adulti della generazione F2 che sono stati genotipati mediante il prelievo di una porzione della pinna caudale. Nella progenie abbiamo riscontrato, come atteso, la presenza di tre diversi genotipi: 93 pesci wild type (30% setd5+/+), 160 pesci eterozigoti (52% setd5+/-) e 57 pesci mutanti (18% setd5-/-); tuttavia, come evidente, la percentuale di individui appartenente ai diversi genotipi non rispetta la trasmissione mendeliana, suggerendo che la mutazione di setd5 in omozigosi determini un aumento della mortalità.
Nel laboratorio ospitante, l'espressione dell’mRNA di setd5 era stata precedentemente analizzata a partire dallo stadio zigotico, dimostrando che tale trascritto ha una componente materna, risultando già presente nell’oocita maturo così come accade per altri mRNA in zebrafish. Abbiamo quindi effettuato incroci mirati tra adulti setd5+/+ e setd5-/- della generazione F2 al fine di analizzare sia l’effetto di perdita di funzione del gene sia il ruolo del trascritto materno di setd5 sugli stadi precoci dello sviluppo di larve della generazione F3. Per analizzare l'impatto dell’mRNA materno, abbiamo confrontato caratteristiche morfometriche (lunghezza corporea e area dell’occhio) in larve di zebrafish con diversi genotipi: larve wild type (dall’incrocio ♀ + / + x ♂ + / +), larve eterozigoti che ricevono mRNA materno di tipo selvatico (dall’incrocio ♀ + / + x ♂ - / -), larve eterozigoti che ricevono mRNA materno esclusivamente mutante (dall’incrocio ♀ - / - x ♂ + / +) e larve mutanti omozigoti (dall’incrocio ♀ - / - x ♂ - / -). Dai risultati ottenuti non vi è una differenza significativa tra la lunghezza corporea delle larve wt e eterozigoti con mRNA materno wt, mentre sia le larve eterozigoti con mRNA materno mutato sia le larve omozigoti mutanti sono significativamente più corte delle larve wt ed eterozigoti con mRNA materno wt. Analizzando l’area dell’occhio delle larve, come indice della dimensione della testa, si assiste ad una riduzione determinata dalla perdita di funzione di setd5 ed inoltre è stato confermato il ruolo fondamentale dell’mRNA materno di setd5 nel determinare questo aspetto morfometrico. Abbiamo quindi valutato l'impatto della mutazione zigotica di setd5 e dell’mRNA materno mutato sui livelli di espressione dello stesso setd5 e di geni che codificano per proteine appartenenti alla stessa famiglia e che potrebbero svolgere una funzione simile a setd5, quali setd2 e mll5, in larve della generazione F3 mediante la tecnica di PCR quantitativa (qPCR). I dati ottenuti escludono la presenza di una differenza significativa nell'espressione dei tre geni analizzati, indipendentemente dal genotipo setd5 delle larve e dal contributo materno di mRNA setd5. Si osserva tuttavia una tendenza in termini di riduzione del livello di mRNA di setd5 nelle larve eterozigoti e ulteriormente nelle larve omozigoti per la mutazione nel gene setd5 che suggerisce un possibile processo di non-sense mediated mRNA decay del messaggero mutante. Inoltre, non vi è una differenza significativa nell’espressione dei geni setd2 e mll5, escludendo un possibile effetto compensatorio risultante dalla perdita di funzione del gene setd5.
L’analisi mediante ibridazione in situ whole mount dell’espressione di setd5 e di alcuni marcatori di specificazione neuronale, quali pax2a, six3a, emx3 e otp-b, su embrioni della generazione F3, è attualmente in corso.
Individui adulti con genotipo setd5+/+, setd5+/- e setd5-/- della generazione F2 sono stati sacrificati al fine di valutare l’espressione di diversi geni coinvolti nella funzionalità neuronale nel tessuto cerebrale adulto. Gli individui sono stati anche sottoposti ad un’analisi morfometrica, in termini di peso e lunghezza corporea. La lunghezza del corpo e il peso corporeo risultano essere significativamente ridotti nei pesci setd5+/- e setd5-/- rispetto ai pesci setd5+/+. I dati ottenuti mediante qPCR dimostrano che l’mRNA di setd5 è significativamente ridotto nei cervelli dei pesci setd5+/- e setd5-/- rispetto ai pesci setd5+/+. L’utilizzo di coppie di primer specifici per le forme wt o delete degli mRNA di setd5 confermerebbe l’ipotesi di un processo di non-sense mediated RNA decay che interessa l’mRNA mutato. Abbiamo inoltre valutato i livelli dei trascritti setd2 e mll5 e, come osservato nelle larve, non risulta esserci alcun effetto compensatorio dovuto alla perdita di funzione del gene setd5. Successivamente l’analisi è stata estesa a gad2, gad1a e gad1b per il sistema GABAergico, hdc per il sistema istaminergico, th1, th2, ddc, dbh, dat per il sistema dopaminergico, serta, sertb, tph1a, tph1b e tph2 per il sistema serotoninergico, vmat codificante per un trasportatore monoaminico vescicolare responsabile del trasporto a livello pre-sinaptico di alcuni importanti neurotrasmettitori, sypa e sypb codificanti per proteine pre-sinaptiche, homer1b codificante per una proteina post-sinaptica ed infine elavl3, un marcatore del differenziamento neuronale. Dai risultati ottenuti si osserva una diminuzione significativa per sypa nei cervelli dei pesci setd5-/- rispetto a quelli dei pesci setd5+/+ e per homer1b tra i cervelli dei pesci setd5+/- e setd5-/- rispetto a quelli dei pesci setd5+/+.
Attualmente è in corso l’analisi dell’espressione di setd5 su sezioni di cervello di individui adulti di zebrafish mediante ibridazione in situ, al fine di caratterizzare la localizzazione di questo trascritto nel sistema nervoso centrale.
In conclusione, osserviamo che la perdita di funzione di setd5 determina un ritardo nello sviluppo delle larve di zebrafish, riconoscendo il ruolo fondamentale dell’mRNA materno nelle prime fasi dello sviluppo. Negli zebrafish adulti i dati finora ottenuti suggeriscono un ruolo di Setd5 nella funzionalità sinaptica, un meccanismo cellulare che è noto essere alterato anche in individui affetti da autismo nell’uomo.
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