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Tesi etd-10232013-171131


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
PUGLISI, CLAUDIA
URN
etd-10232013-171131
Title
Glioblastoma multiforme: valutazione biologica di nuovi inibitori delle metalloproteasi 9 e 12
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott.ssa Giacomelli, Chiara
relatore Dott.ssa Da Pozzo, Eleonora
Parole chiave
  • glioblastoma multiforme
  • metalloproteasi
Data inizio appello
13/11/2013;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il Glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore altamente aggressivo del sistema nervoso centrale, che presenta la peggior prognosi tra i tumori primitivi dell’encefalo: la sopravvivenza media infatti è di 12 mesi, mentre quella a due anni è pari al 10%. E’ classificato come astrocitoma di IV grado, caratterizzato da cellule atipiche scarsamente differenziate, che si replicano rapidamente e che presentano un comportamento molto invasivo.<br>Le terapie attuali per il trattamento del GBM prevedono un primo approccio chirurgico, volto a rimuovere la maggior parte della massa tumorale, seguito da radio- e chemio-terapia, spesso adottate in concomitanza. Sfortunatamente, data la numerosità di staminali tumorali, vi è un’elevata frequenza di recidive in pazienti che hanno già subito un’asportazione chirurgica.<br>Generalmente, l’invasività dei tumori è legata alla capacità delle cellule tumorali di degradare la matrice extracellulare, mediante l’ausilio di numerosi enzimi proteolitici, tra cui le metalloproteasi (MMP) che sono una famiglia di endopeptidasi zinco-dipendenti. Sebbene vi sia un’elevata omologia tra gli elementi di tale famiglia, esse hanno ruoli diversi nella progressione tumorale: alcune sono coinvolte nell’immunità innata e nei fenomeni anti-angiogenici, altre favoriscono l’angiogenesi, la degradazione della matrice e contrastano l’apoptosi, altre ancora presentano entrambi i profili.<br>Alcune tra le metalloproteasi risultano essere iperespresse nel GBM e la loro iperespressione è strettamente correlata con l’aggressività tumorale e il potenziale metastatico. Recenti trials clinici hanno dimostrato che la terapia combinata, usando un agente alchilante il DNA normalmente impiegato nei protocolli terapeutici (Temozolomide) e un inibitore delle metalloproteasi (Marimastat), aumenta il tempo di sopravvivenza dei pazienti. Tuttavia l’utilizzo di inibitori ad ampio spettro delle MMP comporta pesanti effetti collaterali a livello muscolo-scheletrico; da ciò l’esigenza di progettare inibitori selettivi.<br>Nel presente lavoro di tesi sono stati caratterizzati da un punto di vista biologico quattro nuovi potenti inibitori di MMP-9 e MMP-12, due proteasi il cui signalling risulta alterato in molti gliomi.<br>Gli effetti cellulari prodotti dalle nuove molecole, appartenenti alle categorie degli idrossammati e dei carbossilati, sono stati saggiati su tre linee cellulari umane di GBM: U87MG, T98G, U343. Queste tre linee sono state scelte perché in letteratura sono riportate come esprimenti livelli differenti di MMP-9 e MMP-12. Come primo step, sono stati valutati, mediante Real-Time PCR i livelli di mRNA di MMP-9 e MMP-12 paragonando le tre linee cellulari. I livelli di espressione di MMP-9 risultano essere simili per le U87MG e T98G, e molto inferiori per le U343. Viceversa l’espressione della MMP-12 ha presentato il seguente andamento: U87MG&gt;T98G&gt;U343.<br>L’attività dei composti è stata valutata utilizzando concentrazioni nanomolari (5-25 nM) in riferimento all’IC50 mostrata su enzimi ricombinanti in saggi in tube. In particolare è stata analizzata 1) la vitalità cellulare, utilizzando il saggio MTS; 2) l’invasività, mediante il saggio d’invasività su matrigel; 3) la motilità cellulare, mediante lo Scratch assay; 4) i livelli di mRNA di MMP-9 e MMP-12.<br>Precedenti studi cristallografici hanno evidenziato che come questi ligandi siano in grado di indurre omo-dimerizzazione delle MMP; sono quindi stati eseguiti saggi in tube incubando l’enzima ricombinante con i composti e verificando i loro livelli mediante analisi western blot.<br>I risultati hanno evidenziato che i composti sono in grado di inibire l’invasività tumorale e la motilità cellulare, senza influenzare la vitalità. Inoltre, i livelli di mRNA delle MMP-9 e MMP-12 risultano ridotti dopo trattamento con gli inibitori. In ultimo, l’analisi western blot ha permesso di rilevare una riduzione nei livelli di forma monomerica delle MMP a seguito del trattamento, confermando i dati cristallografici.<br>
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