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Tesi etd-10222018-104637


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
NANNETTI, ELEONORA
URN
etd-10222018-104637
Title
Nuove strategie di caratterizzazione molecolare e funzionale di precursori post-mitotici di bastoncelli retinici per l'utilizzo in medicina rigenerativa
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof. Demontis, Gian Carlo Alfredo Giuseppe
relatore Dott.ssa Barravecchia, Ivana
correlatore Prof.ssa Angeloni, Debora
Parole chiave
  • caratterizzazione molecolare e funzionale
  • fotorecettori
  • medicina rigenerativa
Data inizio appello
07/11/2018;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
07/11/2021
Riassunto analitico
La Retinite Pigmentosa (RP) è una malattia genetica che causa la progressiva perdita dei fotorecettori portando a cecità. Sono noti oggi oltre 50 geni la cui mutazione è causa di RP, ed inoltre per uno stesso gene sono note più mutazioni, spesso con fenotipo distinto. Ad oggi non sono disponibili né cure, né trattamenti efficaci per la RP. La ricerca si focalizza su alcuni approcci, tra i quali la terapia genica, la terapia farmacologica ed i neuroprosthetic devices sono quelli maggiormente studiati. Recenti studi hanno mostrato che la terapia rigenerativa potrebbe ripristinare la funzione visiva attraverso il trapianto di precursori dei fotorecettori capaci di sostituire quelli degenerati. Questi nuovi metodi si basano sulla generazione di nuove cellule retiniche a partire da cellule staminali embrionali (ESC) o da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), ottenute tramite riprogrammazione di cellule somatiche adulte, una tecnologia che ha aperto una nuova frontiera nella medicina rigenerativa. Un problema ancora irrisolto degli approcci rigenerativi è la loro bassa resa, in termini di fotorecettori effettivamente impiantati rispetto a quelli trapiantati. Questa problematica è probabilmente legata alla mancanza di criteri efficaci nell’individuare la sottopopolazione dei precursori dei fotorecettori dotati di maggiore probabilità di impianto successivamente al trapianto, causata da una non completa conoscenza degli eventi molecolari che intercorrono tra l’ultima divisione mitotica dei progenitori retinici e la definitiva acquisizione del destino cellulare da parte dei precursori immaturi dei fotorecettori. In questa tesi, per superare i limiti degli approcci utilizzati in precedenza, basati sull’analisi trascrittomica in precursori dei fotorecettori funzionalmente eterogenei, ci siamo proposti di studiare il processo di acquisizione del destino cellulare utilizzando un approccio basato sulla caratterizzazione di singole cellule isolate, a livello sia funzionale che molecolare. Questo approccio è innovativo dato che, la mancanza di una caratterizzazione funzionale negli studi precedenti, non forniva una correlazione tra espressione genica e traduzione in proteina. È infatti essenziale, per poter procedere al sorting, individuare i tempi di latenza tra l’accensione di un gene e la sua traduzione in proteina attiva di membrana e il percorso opposto di “spegnimento”, dato che la presenza del gene è condizione necessaria ma non sufficiente affinché sia espressa la relativa proteina. Combinando varie basi di dati di espressione della retina murina, con il Surfaceome (CSPA) abbiamo selezionato dei geni la cui espressione cambiava sia precocemente (riducendosi) che tardivamente (aumentando) durante lo sviluppo postnatale dei precursori immaturi dei fotorecettori. Abbiamo valutato l’espressione di questi geni mediante qRT-PCR in singole cellule caratterizzate funzionalmente mediante la tecnica del patch-clamp che ha consentito l’analisi delle correnti che permeano attraverso proteine integrali della membrana, i canali ionici. L’insieme di queste informazioni ci ha consentito di comprendere che, durante l’intervallo di tempo, circa 8 giorni, che va dall’ultima divisione mitotica alla definitiva acquisizione del loro destino cellulare, i precursori dei fotorecettori sono dotati di notevole plasticità durante la quale possono deviare dal loro percorso differenziativo ed acquisire un diverso destino. Inoltre, abbiamo messo in evidenza che vari fattori, a cominciare dalla densità cellulare sono in grado di interferire con l’acquisizione del loro destino differenziativo. Infine, un risultato non atteso è stato che i programmi trascrizionali che provvedono alla up-regulation dei geni tipici dei fotorecettori maturi non sono coordinati con quelli che provvedono allo spegnimento dei geni di immaturità, spiegando almeno in parte la plasticità maturativa di queste cellule. Ultimo, ma non per questo meno importante, è l’osservazione di un sostanziale ritardo tra cambiamenti di espressione di un gene e le variazioni della corrispondente proteina in membrana. Nell’insieme questi dati rivelano come gli approcci sino ad oggi utilizzati, basati sul riconoscimento di specifiche proteine di membrana per isolare cellule ad uno stadio di maturazione definito mediante studi di trascrittomica, siano di fatto affetti da un significativo mismatch tra trascrizione e traduzione che pregiudica un effettivo isolamento dei precursori. I risultati consentiranno in futuro di identificare nuove e più efficaci strategie di sorting dei precursori immaturi da utilizzare per i trapianti, al fine di renderli una effettiva opzione terapeutica per i pazienti affetti da RP.
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