• label free
• secretoma
• LC-MALDI TOF/TOF
• proteomica
• aterosclerosi

L’aterosclerosi è una patologia infiammatoria cronica che colpisce le arterie di medio/grande calibro causando l’insorgenza di coronaropatie o di malattie cerebrovascolari, principali manifestazioni cliniche delle patologie cardiovascolari. Essa rappresenta il principale disturbo cardiovascolare responsabile della crescita globale della mortalità. Sebbene nuovi sviluppi farmacologici siano in grado di migliorare lo stile di vita dei pazienti affetti da aterosclerosi, il numero di ricoveri ospedalieri rimane sempre alto suggerendo come i metodi di diagnosi non siano ancora abbastanza tempestivi nel predire l’insorgenza della patologia.
Questa Tesi di Laurea è stata svolta nell’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa e si inserisce in un progetto più ampio finanziato dalla Fondazione Cari Pisa intitolato: “MICROsystems for VAscular diagnosticS and inTervention (MICROVAST)”. Questo lavoro di Tesi si inserisce nell’aspetto biologico del progetto MICROVAST. In particolare rappresenta il punto di partenza di un progetto più ampio che prevede la ricerca di potenziali marcatori della patologia aterosclerotica, in fase avanzata, che possono essere rilevati nel torrente circolatorio dei pazienti tramite l’uso di tecnologie innovative. L’interesse nasce dal fatto che i marcatori proteici, almeno in linea di principio, dovrebbero garantire un’alta specificità e sensibilità nella diagnosi e monitoraggio, e contemporaneamente dovrebbero fornire al clinico ulteriori informazioni circa la patologia.
Lo scopo della Tesi è quello di identificare potenziali marcatori proteici rilasciati dalla placca aterosclerotica di pazienti che hanno subìto intervento chirurgico.
Il metodo scientifico adottato per questa analisi è di tipo induttivo, effettuato tramite un’indagine Proteomica del materiale rilasciato della placca aterosclerotica (“secretoma”). La scelta del secretoma nasce dalla ridotta complessità del suo profilo proteico rispetto al plasma, ma anche dalla sua capacità di riversare gran parte del suo contenuto (proteine o peptidi) nel torrente circolatorio.
I campioni, forniti dall’Azienda Ospedaliera Pisana, U.O. Chirurgia Vascolare, P.O. di Cisanello, (responsabile Prof. M.Ferrari), sono segmenti di arterie iliache umane espiantate da cadaveri sani (campioni di controllo) e segmenti di carotidi umane affette da lesione aterosclerotica avanzata provenienti da pazienti che hanno subìto asportazione chirurgica (campioni patologici). Vengono presi in analisi tre diversi tipi di soggetti: a fronte di una categoria di controllo, i pazienti si distinguono in sintomatici e asintomatici.
L’indagine comparativa prevede un’analisi gel-free che si articola nei seguenti passaggi: (a) preparazione del “secreto” e digestione enzimatica della miscela proteica con tripsina; (b) frazionamento della miscela peptidica mediante nano-HPLC in fase inversa, mescolamento con matrice MALDI e raccolta robotizzata delle frazioni sulle piastre per lo spettrometro di massa; (c) spettrometria di massa di tipo MALDI-TOF/TOF; (d) analisi bioinformatica dei dati provenienti dalla spettrometria di massa (Label-free).
Segue una seconda analisi gel-based, per l’indagine sul grado di frammentazione delle proteine rilasciate dal tessuto, nelle fasi avanzate della patologia. I passaggi seguiti sono: pre-frazionamento della miscela proteica in condizioni denaturanti, mediante SDS-Page, seguito da digestione in-gel con tripsina, estrazione e recupero dei peptidi e successiva analisi come descritto in precedenza.
Nella prima analisi abbiamo identificato un’ampia lista di proteine che per ogni categoria identificano un profilo di espressione. La successiva applicazione di un software dedicato ci ha consentito di eseguire un confronto semi-quantitativo e di riscontrare una serie di proteine differenzialmente espresse tra le tre categorie di campioni. Dalla seconda analisi è emerso che alcune proteine, coinvolte nel processo aterosclerotico, potrebbero presentarsi frammentate a causa dell’ambiente proteolitico che contraddistingue l’ateroma nelle fasi avanzate.
La conclusione di questa indagine indica che le proteine trovate differenzialmente espresse nel secreto sono per la maggior parte coinvolte nei processi di attivazione, adesione e migrazione cellulare lungo la matrice extracellulare, e nei processi infiammatori e coagulativi, dunque strettamente correlate alla progressione della patologia. Inoltre lo stato altamente proteolitico che si verifica negli stadi avanzati della patologia può essere confermato dal ritrovamento di proteine frammentate presenti nel “secreto”. Infine le differenze riscontrate nei livelli proteici, nei due tipi di sintomatologia, potrebbero far ipotizzare meccanismi di rilascio proteico diversi tra il paziente sintomatico e quello asintomatico.
Essendo il punto di partenza di un lavoro di studio più ampio, le diversità riscontrate, dato il numero limitato di campioni, non possono avere un valore diagnostico generale sulla patologia e sul suo possibile grado di complicazione. Tuttavia questo lavoro ha dimostrato come la metodologia applicata sia corretta e appropriata per un’indagine più ampia, che possa in futuro validare statisticamente i valori ottenuti e identificare marcatori effettivi di patologia.